miR-181a在老年急性心肌梗死血清中的表达及其临床意义

丁学智，韩战营，杨巧丽

急性心肌梗死（AMI）是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，高发于老年人，具有高致死率和致残率等特点。近年来多项研究[1,2]指出，micro-RNA不仅在心肌梗死发病时发生显著变化，而且参与调控心肌细胞的坏死和凋亡，是AMI重要生物标志物。

miR-181a位于人类染色体1q32.1位置上，以往关于其的研究主要集中在癌症上，miR-181a不仅与癌细胞对化疗药物的敏感性有关[3]，且可以通过其对靶基因的直接作用对癌细胞的侵袭、迁移、增殖以及凋亡进行调控[4,5]。伊琳等[6]的一项研究发现，miR-181a不仅在自发性大鼠心肌组织中出现差异性表达，而且其表达与血管内皮因子信号通路的调控密切相关。此外，Das等[7]发现，miR-181家族成员可以通过调控下游细胞因子和线粒体相关蛋白的表达而对心肌功能产生影响。但是目前关于miR-181a在老年AMI患者血清中的表达的研究还鲜有报道，本文通过对比不同人群血清miR-181a的表达分析老年AMI血清miR-181a表达与心肌酶学指标的相关性，以揭示miR-181a在老年AMI患者的血清表达及其表达的临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象与分组 选取2016年1月～2017年3月于鹤壁市人民医院心内科收治的老年AMI患者56例为AMI组，其中男性31例，女性25例，年龄60～79岁，平均年龄（69.7+6.5）岁；所有AMI患者均经心电图、心肌酶学等检查，符合世界卫生组织（WHO）制定的AMI诊断标准；同时选取我院健康体检中心体检的52例老年健康受试者（HE）作为HE组，其中男性27例，女性25例，年龄60～81岁，平均年龄（69.4±6.8）岁。排除标准：年龄＜60周岁、肝肾等器官功能障碍、慢性疾病、神经运动系统疾病、严重心律失常、心源性休克，未经治疗死亡以及发病时间不详或发病12 h内未采集血样的患者。本次研究经医院伦理协会批准通过，所有研究对象或其家属均对本次研究内容知情同意。

1.2 血液收集和血清学指标 所有研究对象抽取静脉血5～10 ml，加入EDTA后离心（1000×g）10 min（5810R，Eppendorf AG，Germany）收集血浆。应用免疫层析法试剂盒（鄂械注准20122401709，武汉明德生物，中国）检测人血清心肌肌钙蛋白（cTnI）。应用全自动生化分析仪（迈瑞BS-180，Mindary，中国）检测人血清谷草转氨酶（AST）含量。

1.3 血清miR-181a的提取 以血浆/QIAzol溶解试剂（QIGEN，Germany）为1:5比例向血浆中加入QIAzol溶解试剂，室温静置15 min，然后根据miRNeasy血清/血浆试剂盒（QIGEN，Germany）中的方案提取RNA。最后，使用15ul DEPC水溶解总RNA。

1.4 实时荧光定量PCR 通过One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit（Takara，Japan）将提取的总RNA反转录成cDNA。PCR参数设置：37℃60 min，85℃ 5 s。

RT-qPCR：荧光定量PCR使用SYBR Premix Ex TaqTM II（TakaRa，Japan）试剂盒，并使用ABI 7500荧光定量PCR仪（Applied Biosystems，USA）进行扩增。 PCR参数设置：95℃ 30 s，40℃循环90℃ 5 s，65℃ 30 s。选择U6作为内参照，通过2-△t法（△t = CTmiRNA-CTU6）计算miR-181a的相对表达量。

1.5 统计学分析方法 所有数据均采用SPSS 20.0统计学软件分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，计数资料采用例数（构成比）表示，组间比较采用χ2检验。使用Pearson法分析miR-181a相对表达量与AST和cTnI的相关性，miR-181a对老年AMI的诊断价值用受试者工作曲线（ROC）分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料对比 两组患者在年龄、性别、体质指数（BMI）、吸烟比例、高血压病史、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

2.2 血清miR-181a表达对比 RT-qPCR检测两组的血液miR-181a的相对表达量，结果显示：miR-181a在AMI组的血清相对表达量为（1.18+0.30），显著高于其在HE组的血清表达（1.60+0.27）（P＜0.05，图1）。

2.3 miR-181a表达与AST和cTnI的相关性 在AMI组，miR-181a相对表达量与血清AST含量（r=0.647，P＜0.01）、血清cTnI含量（r=0.738，P＜0.01）呈正相关（图2～3）。

2.4 miR-181a对老年AMI的预测价值 miR-181a的ROC曲线下面积（AUC）为0.842，其95%CI为0.770～0.914。当miR-181a在血清中的相对表达量为1.34时，Youden指数最大，因此miR-181a的诊断阈值为1.34，此时miR-181a诊断老年AMI的敏感性为83.9%，特异性为69.2%（图4）。

3 讨论

表1 两组研究对象一般情况对比

图1 miR-181a在老年AMI患者血清中高表达

图2 AMI组患者血清miR-181a表达与AST的相关性

microRNA是一类在真核细胞中发现的、由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，通过其对靶基因转录的调控参与到真核细胞的分化、增殖、生长和凋亡的调解。在心血管疾病的中，miRNA不仅通过其对靶基因的调控而在心肌肥大、心肌坏死和凋亡中发挥着重要的作用，并且参与到AMI发病的每个过程[8-10]。同时由于miRNA在血液中异常的稳定，并且对各种病理生理条件下表达差异明显，是一种理想的疾病血液检测生物标志物：Liu等[11]研究指出，血浆miR-1，miR-208和miR-499是汉人群AMI的潜在预测生物标志物。

本文研究发现，miR-181a在在老年AMI血清中的相对表达量显著高于其在健康人血清中的表达P＜0.05）。Raut等[12]的研究指出，miR-181a和miR-30c在糖尿病性心肌病中呈现异常表达，并且表达失调的miR-181a和miR-30c协同靶向作用其共同的靶基因p53，进而通过p53-p21信号通路调控心肌细胞的肥大与凋亡。而关于AMI发病机制和致死机理的相关研究已经指出[8,13]，冠状动脉内不稳定的斑块破裂后，引起的血小板活化而启动的凝血级联反应使得血液处于高凝状态，这种处于高凝状态血液极易形成栓塞而导致心肌缺血，最终导致心肌坏死或者凋亡。由此可以看出，miR-181a可能通过对心肌细胞凋亡的调节而参与到疾病的发生发展中。

图3 AMI组患者血清miR-181a表达与cTnI的相关性

图4 miR-181a对老年AMI的预测曲线

为进一步研究miR-181a在老年AMI患者血清中的表达与心肌细胞凋亡之间的关系，本文通过Peasrson法分析老年AMI患者血清中miR-181a的相对表达量与血清AST、cTnI的相关性，结果显示：在老年AMI患者血清中，miR-181a相对表达量与血清AST含量（r=0.647，P＜0.01）、血清cTnI含量（r=0.738，P＜0.01）呈正相关。AST是一个与心肌细胞损伤、凋亡或者坏死密切相关的心肌酶，当发生心肌损伤或者坏死时，其在血清中的表达量将显著升高。CTnI是心肌肌钙蛋白的一个亚型，在正常生理情况下，外周血cTnI的表达量极低（0～0.3 ug/L），但当发生心肌梗死时在血液中的含量会在2～3 h内可检测到升高，并在24～28 h内达到峰值，也正因为其对心肌损伤有高度敏感性和特异性，所以其是欧洲和美国的指南中所强调使用的诊断AMI的首选生物标志物[14]。由此可以看出，miR-181a与心肌损伤、坏死或者凋亡有关。同时，Das等[7]的发现也从另一个侧面指出，miR-181a是通过对其下游靶基因的作用而参与到对心肌细胞的损伤、坏死或凋亡调解中。

miR-181a对老年AMI的预测分析显示最佳界值为1.34，敏感性为83.9%，特异性为69.2%，AUC为0.842，其95%CI为0.770～0.914，提示miR-181a对老年AMI患者诊断具有一定价值[15]。

综上所述，miR-181a在老年AMI患者血清中呈现高表达，并且其可能是诊断老年AMI潜在的生物标志物。

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