巨菌草一株内生固氮菌的分子鉴定及生物学特性

叶文雨 谢序泽 杨林青 邱学鸿牛晓庆 胡红莉 余文英 鲁国东

摘要 菌草（JUNCAO）是可作为栽培食用菌、药用菌的草本植物。内生固氮菌具有生物固氮的功能，可以促进植物生长，提高植物对病原菌的拮抗作用。采用无氮培养基、乙炔还原法等方法从巨菌草根中分离纯化到1株具有较强固氮酶活性的菌株，固氮酶活性值为270.20 nmolC₂H₄/（mL·h）。通过16S rDNA序列分析，进一步确定该菌株属于变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）。内生固氮菌株fjg102对稻瘟病菌Guy11和Ku70的抑菌率分别为40.25%和44.30%，具有一定的抑制病原菌的作用。菌株fjg102革兰氏染色阳性，具有溶磷作用、触酶反应为阳性、明胶液化为阳性等生理生化特性。盆栽试验结果表明，接种fjg102菌株后对大麦有明显的促生作用。其中叶长增加37.26%，根长增长9.40%，根重增加66.16%，鲜重增加96.40%，干重增加80%。可见，该内生固氮菌株具有生物固氮和促生的效果，可进一步研究开发成为微生物肥料生产菌种。

植物的生长需要各种营养元素，氮是生长发育必须的大量营养元素之一。空气中的氮必须通过固氮微生物的转化植物才能利用[1-2]。植物内生固氮菌（Endophytic diazotroph）是指那些定殖在健康植物体内，与宿主植物进行联合固氮的一类微生物[3-4]。发掘植物内生固氮菌资源遗传多样性已成为非豆科作物高效利用生物固氮战略的主攻方向之一。内生固氮菌可以促进植物生长、抑制植物病害、提高植物产量、降低化肥使用量，减少水土污染、保持农业可持续发展、改善生态环境[15]。内生固氮菌有利于营养供应和微环境适宜的生态位，避免了化合态氮的抑制及土著微生物的竞争，进而促进作物的生长及产量的提高[6-7]。野生稻内生菌根瘤菌（Rhizo-bium）、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）等对水稻纹枯病有一定的抑制作用[8]，芽孢杆菌（Bacillus）对赤霉病等病害可产生良好的防治效果[9]。高玲玲等[10]研究发现，多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）对水稻白叶枯病、条斑病、稻瘟病、纹枯病和恶苗病等5种主要病原菌都有抑制作用。

菌草（JUNCAO）是可作为栽培食用菌、藥用菌的草本植物。巨菌草属于禾本科植物狼尾草属，具有营养丰富、植株高大、单位面积产量高、适应性强、资源丰富、易于人工栽培、资源可持续利用等生物学特性，有较高的研究、开发和利用价值[11]。目前为止，已从甘蔗、水稻、小麦、玉米、白菜、芹菜等植物中分离到内生固氮菌[12]，但对巨菌草内生固氮菌的研究较少。为了探明巨菌草体内是否存在高效的固氮菌及其固氮机理，本研究通过纯培养手段和分子生物学手段对福州巨菌草内生固氮菌进行了分离及生物学特性研究，以期揭示内生固氮菌的特征，为丰富固氮微生物菌种资源库和开发利用巨菌草内生固氮菌提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2014年3月，采于福建农林大学后山贫瘠山坡荒地，采集生长良好的巨菌草植株，立即用白封袋密封，带回实验室放入4℃冰箱中保存备用。

1.2 培养基

Dobereiner改良无氮培养基（简称DN） [13]： Sucrose 10 g/L; Malicacid5g/L; K₂HPO₄·H₂O₂ 0.2g/L;NaCl 0.1g/L; KH₂PO₄·H₂O₂ 0.4 g/L; FeCl₃ 0.01g/L;Na₂MoO₄ 0.002 g/L; MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L（单独灭菌）;CaCl₂·H₂O 0.02 g/L（单独灭菌）;Agar 1.5%/L（固体）;Agar 0.2%/L（半固体）;pH调至7.0;NFb培养基[14];malic acid 5.0 g/L， K₂HPO₄ 0.5 g/L; MgSO₄·7H₂O0.2 g/L; NaCl 0.1 g/L; CaCl₂ 0.02 g/L; bromthymolblue 0.5% （in KOH 0.2 mol/L）2.0 mL/L;

vitaminsolution 1mL/L; micronutrient solution 2mL/L;1.64% Fe-EDTA solution 4mL/L; KOH4.5 g/L; pH调至6.8。其中vitamin solution. biotin 100 mg/L;pyridoxol-HCl：200 mg/L; micronutrient solution： CuSO₄ 0.4g/L; ZnSO₄·7H₂O 0.12 g/L; H₂BO₃1.4g/L; Na₂MoO₄·2H₂O 1.0g/L; MnSO₄ 1.5 g/L（固体培养基中加入Agar 15 g/L.半固体培养基中加入Agar 2-4 g/L）;加碘反应和触酶反应用LB固体培养基（LB液体培养基加琼脂15g/L）;内生细菌的运动作用用LB半固体培养基（胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂5g/L）：无机磷溶解PKO培养基（FeSO₄0.003 g/L，葡萄糖10g/L， Ca₃（PO₄）₂ 5.0 g/L，

（NH₄）₂SO₄0.5 g/L， MnSO₄0. 03 g/L，0.03g MgSO₄·7H₂O/L， NaCl 0.2 g/L， KCl 0.2 g/L，酵母膏0.5 g/L，琼脂20 g /L， pH值6.8-7.0。其中Ca₃（PO₄）₂。过筛并单独灭菌后与培养基混合）;淀粉水解用培养基（可溶性淀粉2g/L，NaCl 5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，琼脂15g/L，配好后调PH至7.0）;明胶液化培养基（牛肉膏蛋白胨液体培养基1000mL/L，明胶12g/L，在水浴锅中熔化混匀，调PH至7.2～7.4，121℃高压灭菌，30 min）：病原菌拮抗试验用PDA固体培养基（马铃薯葡萄糖琼脂40.1 g/L）。

1.3 菌株的分离、纯化

菌株的分离、纯化[14];将采集的新巨菌草植物样本先用自来水冲洗，然后用剪刀剪下根并分别置于已灭菌的2个培养皿中，接着用70%的乙醇（C₂H₂OH）处理5 min（除去根表面的腐烂物质），无菌水洗涤多次，再用2%的次氯酸钠（NaCIO）消毒2～3min，无菌水洗涤5～7次.每次5～10 min。最后将表面消毒完全的根用手术刀切碎，分别接种到3支装有NFb半固体培养基的试管中，密封后，置于温度为28℃，湿度为85%的人工培养箱内进行培养。待24 h后，向管内注入1%体积的乙炔气体，在同样条件的人工培养箱内培养24 h，测定其固氮酶活性。将具有固氮活性的混合菌株接至固体NFb培养基上进行培养。再挑取单菌落分别涂板直到得到纯的菌株为止。

1.4 内生茵形态、培养特征

取培养48 h的菌株进行革兰氏染色，观察内生菌的形态特征。

1.5 气相色谱法测定固氮酶活性

固氮酶活性测定采用乙炔还原法[15]。将已纯化的菌株再次接入盛有NFb半固体培养基的试管内，密封后，置于温度为28℃，湿度为85%的人工培养箱内进行培养。待24h后，向10mL试管内注入1%体积的乙炔气体，在同样条件的人工培养箱内培养24h，用SP-2100气相色谱仪（北京分析仪器厂）测定其固氮酶活性。用下列公式计算固氮酶活性大小：N= （hx×C×V）/（hs×24.9×t），式中，hx为样品峰值（峰面积）;hs为标准C₂H₄峰值（峰面积）;C为标准C₂H₄的浓度（nmol/mL）;V为培养容器体积（mL）;t为样品的培养时间，即C₂H₄的反应时间（h）;N为产生的C₂H₄浓度（nmol/mL·h）。挑取固氮酶活性较高的样品，用20%甘油于-20℃保存备用。

1.6 16S rDNA基因扩增

试剂盒抽提法提取内生菌DNA。16S rDNA基因序列PCR扩增引物为细菌通用引物，27F（5'AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）進行16S rDNA扩增。PCR反应体系总体积为25μL，Taq Mix DNA聚合酶12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板DNA1μL，去离子水10.5μL。PCR反应程序为94℃预变性5min; 94℃变性30s，56℃退火90s，72℃延伸2min， 30个循环;72℃延伸10min，4℃保存。反应完成后用1%的琼脂糖电泳检测PCR产物。扩增产物送华大基因生物技术有限公司测序。测序结果在GenBank （http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast）中进行BLAST，选取与目标菌株相似性较近的菌株序列，使用ClustalX软件进行同源性比对;利用MEGA 5.2软件采用邻近法（neighbor-joiningmethod）聚类分析并构建系统发育树，设定Bootstrap为1000，初步确定菌株的分类地位。

1.7 生物学特性

运动性试验、触酶试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、溶磷能力等试验参照《微生物学实验》[16]进行。

1.8 促生实验

将活化得到的单菌落采用LB液体培养基于28℃培养48h，培养得到的培养液（OD₆₀₀=0.6）.大麦生长3～4 d后，每盆浇灌菌液15 mL，同时浇灌同样祥体积的清水作为对照，15d后测量大麦的叶长、根长、鲜重、干重等，计算菌株对大麦的促生作用。

2 结果与分析

2.1 菌株形态、培养特征

在固体LB培养基上28℃培养24h后，菌株fjg102形成乳白色不透明菌落，菌落近似圆形，边缘整齐，中间有小突起，不分泌色素（图1-A）;fjg102菌体细胞为短杆状，革兰氏阻性（图1-B）。

2.2 分离纯化及固氮酶活性的测定

采用培养基培养法从巨菌草（图1-C）根中分离纯化得到一株内生固氮菌菌株fjg102。对该菌株用乙炔还原法进行固氮酶活性测定，其固氮酶活性值为270.20 nmol/mL·h，表明该菌株具有较强的固氮酶活性。

2.3 16S rDNA序列分析及系统发育

扩增菌株16S rDNA约1500 bp长度的扩增产物，扩增产物交华大基因有限公司进行测序。将获得的序列输入到Genbank数据库中进行BLAST比对。将相似性比较相近的模式菌株序列用MEGA5.2软件，采用邻接法构建系统发育树（图2-A）。结果表明，菌株fjg102与变栖克雷伯氏菌（Kleb-siella variicola）亲缘关系较近.其序列相似性均为99%）。结合其形态及其生理生化特征将fjg102可归为变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）。

2.4 菌株的生理生化特性

2.4.1 触酶试验

触酶可以催化将过氧化氢分解成为水和氧的反应，触酶的功能是将代谢过程产生的、具有毒性的过氧化氢除去，以保护细菌不被伤害。菌株fjg102触酶反应均为阳性（图4），说明它们具有排除代谢中产生的过氧化氢的能力。

2.4.2 溶磷圈的产生

采用溶磷圈法菌株的溶磷性，巨菌草内生菌fjg112菌株的周围有溶磷圈出现，溶磷能力检测的结果表明，该菌株具有溶磷能力，溶磷能力D/d（透明圈得直径与菌落的直径的比值）为1.07，具有一定的溶磷能力（图4）。

2.4.3 运动性试验

采用半固体培养基穿刺接种法，培养后观察接种线及其周围的生长状况，有动力的细菌可在接种线周围生长，造成模糊。无动力的则接种线清晰可见，周围无生长。巨菌草内生菌fjg102菌株的运动性检测的结果表明，该菌株接种线清晰可见，说明该菌株不具有运动性能（图5-A）。

2.4.4 明胶液化试验

某些细菌可产生一种胞外酶明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，半固体的明胶培养基成为流动的液体。试验结果表明，菌株fjg102具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，具有明胶液化现象（图5-B）。

2.4.5 拮抗真菌实验

采用平板对峙法检测菌株fjg102对病原真菌的抑制效果，结果表明fjg102菌株对稻瘟病菌Guy11和Ku70的抑菌率分别为40.25%和44. 30%，对病原真菌具有一定的拮抗作用。

2.4.6 内生固氮菌对大麦的促生作用

将活化得到的单菌落采用LB液体培养基于28℃培养48h，培养得到的培养液（OD₆₀₀=0.6）每盆浇灌15mL于生长一周左右的大麦根部。15d后与未接种的对照相比，对大麦有明显的促生作用（图6）。其中叶长增加37.26%，根长增长9.40%.根重增加66.16%，鲜重增加96.40%，干重增加80%（表1）。

2.4.7 菌株对大麦的致病性分析

将活化得到的单菌落采用LB液体培养基于28℃培养48h，培养得到的培养液（OD₆₀₀=0.6），接培养菌液于生长一周左右的大麦的叶片进行离体接菌，每处理重复3次，5～7d后调查叶片发病情况并拍照。结果表明菌株fjg102对大麦叶片没有致病性（图7）。

3 结论与讨论

内生固氮菌定殖于植物内部，在植物细胞内、细胞间隙、木质部导管等进行固氮及其它促生作用。内生固氮菌不仅能为宿主植物提供氮营养元素，而且还能促进植物生长，增强植物的抗逆性，是一类具有巨大应用潜力的微生物资源。自内生菌研究以来，许多学者在不同的植物中分离到了不同种的内生固氮菌。如胡文哲等[17]从广西野生稻分离到了5个内生固氮菌类群;刘天增等从狗牙根中分离到内生固氮菌等。已有学者从水稻、甘蔗等植物中分离到了变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）。已有研究表明，固氮菌能在甘蔗根和地上部分组织内生存和定殖，可以有效促进甘蔗植株生长和對矿质营养的吸收[18-20]。刘璇等[21]分离的固氮菌具有解钾能力。龚凤娟等[22]分离的固氮菌具有较高的ACC脱氨酶活性。葛安辉发现与变栖克雷伯氏菌（Kleb-siella variicola）的相似性高达99%联合固氮菌株，羧甲基纤维素和甘油的添加能显著提高该菌株的固氮酶活性[23]。本研究以福建巨菌草的根为材料，采用不同的选择性培养基进行分离和纯化，分离得到一株内生固氮菌，经16S rDNA系统发育分析，初步鉴定为变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola），表明该内生固氮菌具有较高的固氮酶活性。该菌株还具有溶磷性、触酶反应为阳性、明胶液化为阻性等生物学特性。因此，本研究分离得到的变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）菌株在菌肥方面具有非常好的应用前景。

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