蓝莓根腐病生防细菌的筛选与鉴定

叶婵，周南，蒋选利

(1.贵州大学农学院，贵州 贵阳 550025； 2. 贵州山地农业病虫害重点实验室，贵州 贵阳 550025)

由真菌引起的蓝莓病害已达20 种以上[1-2]。蓝莓根腐病(Fusariumoxysporum)是一种真菌性维管束土传病害，植株只要发病即可导致整株死亡，是蓝莓生产上的主要病害；该病害在贵州省黔东南黄平、麻江、丹寨等县以及黔西南、黔南部分蓝莓种植地区广泛发生[2]。该病害的防治措施目前以化学防治为主，但长期使用农药会带来生态环境安全问题；利用微生物及其代谢产物防治植物病害已成为植物病害生物防治技术的发展趋势[3]。

筛选生防菌是生物防治的基础，也是生物防治成功与否的关键。张宝 等研究发现，解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens对尖孢镰刀菌有很强的抑制作用[4]，该菌株对棉花枯萎病有较好的田间防治效果[5]，该菌发酵液对尖孢镰刀菌也有较强的抑制作用，能形成明显的抑菌圈[6]。曹云 等研究发现，枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis对尖孢镰刀菌有良好的拮抗效果[7]，对尖孢镰刀菌引起的根腐病防效高达73.60%[8]，其发酵液对尖孢镰刀菌菌丝的生长和孢子的萌发也有很好的抑制作用[9]。刘莲娜 等研究发现贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis对尖孢镰刀菌有较强的抑菌活性[10]，其胞外分泌蛋白对尖孢镰刀菌也有一定的抑制效果[11]，该菌还能抑制尖孢镰刀菌黄瓜专化型菌丝的生长和分生孢子的萌发，而且其发酵液也具有很强的抑制作用[12]。

为了促进有机蓝莓的生产，保障蓝莓产业的健康发展，作者进行蓝莓根腐病生防菌的筛选与鉴定试验，探寻控制蓝莓根腐病的生防细菌，以期为研发蓝莓根腐病生防制剂提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 土壤样品的采集 2015—2016年在贵州省麻江县和丹寨县蓝莓果园，先后5次从蓝莓植株根围采集土壤土样60份。拨开表层土约10 cm，采集蓝莓植株根围土约50 g，装袋并带回试验室。

1.2 细菌的分离纯化 采用土壤稀释法分离土样中的细菌，每个浓度设置3个重复。待平板上长出明显单菌落，用NA培养基纯化单菌落并斜面保存分离的菌株，供筛选。

1.3 拮抗菌株的筛选 采用平板对峙法测定各分离菌株对蓝莓根腐病菌尖孢镰刀菌(贵州大学农学院植物病理学实验室提供)的抑菌活性，以只在平板中心处接种病原菌为对照(CK)。初筛设置3个重复，对拮抗效果较好的菌株进行复筛，复筛设置5个重复，28 ℃培养5 d。测量相对拮抗细菌方向病原菌生长的直径(D)和抑菌带宽度(d)，计算抑制率。

抑制率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-0.5 cm)×100

1.4 盆栽接种抑菌测定 选择抑制率较高的B6、B7和B10菌株，在大棚条件下进行盆栽接种抑菌测定。选用长势一致的蓝莓幼苗兔眼6号(由贵州省麻江县果品工程中心提供)，连带育苗基质移栽至直径30 cm的营养钵，加黄壤营养土，经高温灭菌、自然放凉后每盆移栽1株幼苗。试验设置4个生防菌处理和1个对照处理，每个处理均盆栽15盆蓝莓幼苗。拮抗菌B6、B7和B10细菌悬液处理浓度均为1×108CFU/mL，蓝莓根腐病的病原菌尖孢镰刀菌菌悬液接种浓度为1×106CFU/mL，接种后30 d调查发病情况，以发病率表示盆栽抑菌效果。处理1：分别用B6、B7和B10细菌悬浮液300 mL处理盆栽蓝莓幼苗，48 h后接种100 mL尖孢镰刀菌菌悬浮液；处理2：分别用B6、B7和B10细菌悬浮液300 mL处理盆栽蓝莓幼苗，然后立即接种100 mL尖孢镰刀菌菌悬浮液；处理3：先用100 mL尖孢镰刀菌菌悬浮液接种蓝莓幼苗，48 h后分别用B6、B7和B10细菌悬浮液300 mL处理；处理4：先用100 mL尖孢镰刀菌菌悬浮液接种盆栽蓝莓幼苗，96 h后分别用B6、B7和B10细菌悬浮液300 mL处理；对照：以100 mL尖孢镰刀菌菌悬浮液接种盆栽蓝莓幼苗、浇灌300 mL清水。计算发病率。

发病率(%)=发病株数/总株数×100

1.5 生防细菌的鉴定 采用形态学观察和分子生物学方法鉴定。即通过显微镜直接观察菌落及菌体形态，以及革兰氏染色反应、芽孢染色后的观察，初步鉴定生防细菌的种类。然后用Biomiga公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取生防细菌的DNA，参考韦鑫[13]的PCR程序设置和反应体系，以细菌DNA为模板，用细菌通用引物27f(5′ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′)和1492r(5′TACGGCTACCTTGTTACGACTT 3′)进行16S rDNA基因片段的扩增。由昆明硕擎生物工程有限公司对未纯化PCR产物进行双向测序，将所得测序通过Blast与已知序列进行同源性分析和序列比对。

1.6 数据分析 生防细菌抑菌率测定的数据和盆栽抑菌试验数据分别采用SPSS 21.0软件和Excel 2007进行分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株筛选结果 土壤中分离的538株细菌经过初筛和复筛得到了10株对尖孢镰刀菌抑菌活性较好的菌株，各处理菌落直径显著低于对照(CK)菌落直径，B7处理的抑菌带最宽(图1)。10株生防细菌的抑制率及其差异显著性见表1，其中B6，B7，B9的抑制率分别为83.89%，82.44%，79.39%;极显著大于B2，B3，B4(P<0.01)；而与B8，B10均无显著性差异。

表1 生防细菌对尖孢镰刀菌的抑菌作用测定

注：同列不同大写字母表示组间差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)，相同小写字母表示组间差异不显著(P>0.05)。

图1 生防细菌对尖孢镰刀菌的抑制作用

2.2 盆栽幼苗抑菌测定结果 生防细菌B6、B7和B10菌株在盆栽蓝莓幼苗上对蓝莓根腐病原菌尖孢镰刀菌均有一定的抑菌效果。其中以B6菌株的抑菌效果最好，4种方式处理后蓝莓幼苗发病率均低于B7和B10菌株，最低发病率仅为13.3%。4种不同时间处理间，抑菌效果明显不同，以拮抗菌处理幼苗后立即接种病原菌(处理2)的抑菌效果最好(表2)。

表2 3株生防细菌不同方式处理后盆栽蓝莓幼苗的发病率 %

2.3 生防细菌鉴定结果

2.3.1 形态特征和染色结果 10株生防细菌菌落均呈乳白、不透明、表面光滑或粗糙、边缘整齐或不整齐的圆形或规则或不规则状；显微镜油镜下，菌体均呈具方端或圆端直杆状，革兰氏染色均为阳性，均呈紫色(图2)，芽孢染色菌体均呈蓝色，都能产椭圆形或圆形芽孢(图3)。结果表明，所鉴定的10株生防细菌均为芽孢杆菌属Bacillus细菌。

2.3.2 分子生物学鉴定结果 一般来说，同源相似性大于97%的两株细菌就是同种[14]。通过Blast进行序列比对和同源性分析后，发现10株拮抗细菌与已知菌株的同源相似性均大于99.5%，9株为已知菌种(表3)。

图2 10株生防细菌革兰氏染色结果

图3 10株生防细菌芽孢染色结果

菌株相似菌株登录号 相似性B1Bacillus sp.HQ31716799.9%B2B. amyloliquefacien解淀粉芽孢杆菌NR_041455.199.7%B3B. amyloliquefaciens subsp. 解淀粉芽孢杆菌亚种JF89925399.9%B4B. subtilis枯草芽孢杆菌EU48951799.8%B5B. siamensis暹罗芽孢杆菌KT781674.199.9%B6B. siamensis暹罗芽孢杆菌KY643639.199.9%B7B. velezensis贝莱斯芽孢杆菌KY694464.199.9%B8B. tequilensis特基拉芽孢杆菌NR_104919.199.6%B9B. subtilis subsp. 枯草芽孢杆菌亚种CP010052.199.8%B10B. amyloliquefaciens解淀粉芽孢杆菌FN597644.199.9%

3 结论与讨论

采用形态学和分子生物学相结合的方法，鉴定9株生防细菌分别为解淀粉芽孢杆菌3株、枯草芽孢杆菌2株、暹罗芽孢杆菌2株、贝莱斯芽孢杆菌1株、特基拉芽孢杆菌1株。其中暹罗芽孢杆菌B6菌株对尖孢镰刀菌的抑制率高达83.89%，其次是贝莱斯芽孢杆菌B7菌株和枯草芽孢杆菌B9菌株。平板对峙中抑制率较好的株暹罗芽孢杆菌B6菌株、贝莱斯芽孢杆菌B7菌株、解淀粉芽孢杆菌B10菌株对尖孢镰刀菌盆栽幼苗接种抑菌试验中，以B6菌株的抑菌效果相对最好，发病率仅为13.3%；拮抗菌不同时间处理的抑菌效果差异明显不同，以拮抗菌处理幼苗后立即接种病原菌的抑菌效果相对最好，其次是拮抗菌处理幼苗48 h后接种病原菌与接种病原菌48 h后拮抗菌处理幼苗，其中以接种病原菌96 h后拮抗菌处理幼苗的抑菌效果相对最差。

目前，国内外对尖孢镰刀菌的生防细菌研究较多的是解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌Bacilluspolymyxa等。本试验筛选出的解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌对尖孢镰刀菌的的拮抗效果与其相似，说明这些菌株类群在尖孢镰刀菌生物防治方面具有较好效果和稳定性。

国内关于暹罗芽孢杆菌的报道较少，仅研究报道暹罗芽孢杆菌的发酵液及其发酵液粗产物对尖孢镰刀菌有很好的抑菌活性[15]。本试验筛选出的暹罗芽孢杆菌的平板拮抗效果(83.89%)和盆栽抑菌效果均最好，蓝莓幼苗发病率仅为13.3%，因此开发和利用暹罗芽孢杆菌用于尖孢镰刀菌的生物防治方面前景广阔。本文首次报道特基拉芽孢杆菌对尖孢镰刀菌具有较好的拮抗作用，其抑制率高达77.12%，但平板检测只是特基拉芽孢杆菌的室内筛选结果，要确定其真正的生防作用，还需进一步的田间试验。暹罗芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌是对土传真菌性病害具有拮抗作用的细菌，且对尖孢镰刀菌的拮抗效果显著，但未见暹罗芽孢杆菌和特基拉芽孢杆菌用于防治植物病害，是否可以作为生防菌还需要进一步的安全性评价。

由于仅见蓝莓根腐病病原和蓝莓根腐病发生情况调查的相关基础研究的报道[2,16-17]，目前国内外尚未建立蓝莓根腐病病情分级标准。本试验从蓝莓根围土中筛选蓝莓根腐病的生防菌，采用发病率来表示生防细菌对盆栽蓝莓幼苗根腐病病原菌尖孢镰刀菌的抑菌效果，可能比较粗糙，为了更好表示蓝莓根腐病的发病程度及其防治效果，建立科学的蓝莓根腐病病情分级标准是非常必要的。