含铬革屑碱酶结合法提取水解胶原蛋白

王小卓，温会涛*，梁永贤，杨义清，王坤余，但卫华

（1.兴业皮革科技股份有限公司，福建晋江362261；2.福建省皮革绿色设计与制造重点实验室，兴业皮革科技股份有限公司，福建晋江362261；3.四川大学制革清洁技术国家工程实验室，四川成都610065）

1 引言

皮革行业是我国轻工行业的支柱产业，为经济发展做出了重要贡献，但随着制革规模不断扩大，产能无序扩张，带来了一定的环境污染问题[1]。据统计[2-4]，1t原料皮只能产出200 kg成品革，却会产生超过600 kg固体废弃物，其中被列入危险固废的含铬皮类固废约为250 kg，其主要成分为胶原蛋白和Cr2O3，以干基计，含铬废弃物中Cr2O3含量约为4.0%，胶原蛋白含量约为80%[5-6]，若采用传统的填埋方法，不仅会给环境带来极大的污染，而且会造成资源的大量浪费。

含铬废弃物资源化利用可以不脱铬直接利用，也可以脱铬后分别回收铬和胶原蛋白进行高值利用[7]。脱铬是破坏铬与胶原羧基的配位键，从而使铬与胶原分离。按照水解助剂的不同，水解方法可分为氧化法、酸法、碱法、酶法和综合法等[8]。氧化法脱铬不彻底，需多次重复脱铬，造成胶原损失和成本增加，而且易产生剧毒的Cr6+；酸法对胶原分子降解较大，产物相当分子质量较小，胶原提取率和脱铬率都比较低，而且酸液对设备的腐蚀较大；碱法对胶原分子降解较大，产物分子量较小，但是胶原提取率和脱铬率都较高；酶法反应条件温和，对胶原蛋白分子破坏较小，是一种较优越的水解方法，但是胶原提取率和脱铬率都较小。碱法水解具有较高的胶原提取率和脱铬率，但是仍会残留部分未水解完全的铬渣，采用酶法对铬渣进行二次水解，可进一步提高胶原提取率。

利用含铬废弃物经脱铬制备皮革化学品，使制革含铬固体废弃物在制革行业封闭循环利用，是对生物质资源——胶原蛋白和国家战略性资源——铬的高值再利用。

2 实验部分

2.1 实验材料与仪器

2.1.1 主要材料

含铬革屑，兴业皮革科技股份有限公司鞣制后削匀产生的革屑；氧化钙，AR，西陇化工股份有限公司；氢氧化钠，AR，西陇化工股份有限公司；二水合草酸，AR，西陇化工股份有限公司；碳酸氢钠，AR,广东汕头达濠精细化学品有限公司；氧化镁，AR，广东汕头达濠精细化学品有限公司碱性蛋白酶，生物试剂，上海蓝季科技发展有限公司；中性蛋白酶，生物试剂，上海蓝季科技发展有限公司。

2.1.2 主要仪器

PHSJ-4F型pH计，深圳市华鑫计量仪器有限公司；KD-2100TEC型精密电子天平（精密度0.01g），福州科迪电子技术有限公司；JJ224BC型精密电子天平（精密度0.0001g），常熟市双杰测试仪器厂；HZS系列水浴恒温振荡器，金坛市科欣仪器有限公司；DK-98-II型电子调温万用电炉，天津市泰斯特仪器有限公司。

2.2 实验方法

2.2.1 含铬革屑预处理

首先用自来水冲洗削匀含铬革屑3-4遍；然后加入洗涤剂揉搓，用自来水冲洗后再重复冲洗至干净为止；最后将洗涤干净的含铬革屑烘至恒重，置于干燥器中保存，备用。

2.2.2 含铬革屑碱法水解

在三角瓶中加入5g含铬革屑，50g水，0.3 g碱性材料，搅拌均均，置于（70±0.2）℃的恒温水浴振荡器中反应3h，冷却后抽滤，得到胶原水解液；并探讨碱性材料用量、反应温度、反应时间对含铬革屑脱铬率及胶原蛋白提取率的影响。

2.2.3 含铬残渣酶法水解

在三角瓶中加入5 g经碱性材料处理后的含铬残渣，按表1所示的方法加入蛋白酶，控制反应温度、反应pH，冷却后抽滤，得到胶原水解液；并探讨酶种类、酶用量、酶反应温度、酶反应pH对胶原蛋白提取率的影响。

2.3检测方法

2.3.1 含铬革屑主要技术指标

水分含量参照轻工行业标准（QB/T 2717-2005）进行测定[9];Cr2O3含量参照轻工行业标准（QB/T 2720-2005）进行测定[10];pH参照轻工行业标准（QB/T 2724-2005）进行测定[11];灰分含量参照轻工行业标准（QB/T 1274-2012）进行测定[12]。

2.3.2 胶原蛋白提取率

采用重量分析法进行检测。将胶原水解液过滤2-3次，滤液定容至100m L，用移液管移取10m L至称量瓶中，放入（102±2）℃烘箱烘至恒重，在干燥器中冷却至室温，称量，可采用下式计算胶原蛋白提取率。

式中：W—胶原蛋白提取率（%）；

m0—称量瓶的质量（g）；

m1—含铬革屑干重（g）；

m2—称量瓶和干燥后胶原水解物质量（g）。

2.3.3 胶原蛋白铬含量

将胶原水解液过滤2-3次，干燥得到胶原蛋白粉，参照轻工行业标准（QB/T 2720-2005）测定胶原蛋白中Cr2O3含量[10]。

2.3.4 脱铬率

从2.3.1、2.3.3中分别得到含铬革屑、胶原蛋白中的铬含量，可采用下式计算脱铬率。

式中：W—脱铬率（%）；

C1—含铬革屑铬含量（m g/g）；

C2—胶原蛋白铬含量（m g/g）。

3 结果与分析

3.1 含铬革屑主要技术指标

含铬革屑为兴业皮革科技股份有限公司鞣制后削匀产生的革屑，经检测，其pH值，水分含量，灰分含量，Cr2O3含量如表2所示。

从表2可以得到含铬革屑胶原蛋白含量约为80%，Cr2O3含量约为4%，若不加以回收利用，将会造成大量的资源浪费，同时会对环境带来一定的污染。

3.2 碱性材料对比

分别采用 CaO、MgO、NaOH、NaHCO3四种碱性材料水解含铬革屑，以胶原提取率和脱铬率为评价指标，其结果如图1所示。

从图 1可以看出，用 NaOH、CaO、MgO、NaHCO3水解含铬革屑，胶原提取率依次为87.5%，56.3%、53.7%、13.4%，脱铬率依次为 90.16%、98.38%、98.18%、89.69%。NaOH会对胶原蛋白造成严重破坏，所得蛋白分子量很小，且过量NaOH可与Cr(OH)3反应生成水溶性NaCrO2，使得胶原水解液铬含量增大。CaO、M gO反应温和，其中CaO水解法胶原提取率、脱铬率优于M gO水解法，且CaO价格更便宜，故采用CaO为进行水解含铬革屑。

3.3 CaO法水解条件优化

CaO水解含铬革屑，反应条件温和，脱铬率和胶原提取率较高，所得水解液铬含量低，而且CaO价格便宜，故对CaO水解法进行优化，探讨CaO用量、反应温度、反应时间对含铬革屑脱铬率及胶原提取率的影响。

3.3.1 C aO用量对胶原提取率和脱铬率的影响

表1 蛋白酶处理铬屑残渣的条件Tab.1 The conditions of protease for treating chrome residues

表2 含铬革屑主要技术指标Tab.2 Main qualification of chrome shavings

图1 不同碱性材料水解效果比较Fig.1 Com parisonofdifferentalkalinematerials forhydrolyzingeffect

图2 CaO用量对胶原提取率和脱铬率的影响Fig.2 Influence of Cao dosage for collagen extraction rate and dechrom ing rate

图3 CaO反应温度对胶原提取率和脱铬率的影响Fig.3 Influence of CaO reaction tem perature for collagen extraction rate andchrom ing rate

图4 CaO反应时间对胶原提取率和脱铬率的影响Fig.4 Influence of CaO reaction time for collagen extraction rate and dechrom ing rate

在反应温度为70℃，反应时间为5 h的条件下，采用4%、6%、8%和10%的CaO对含铬革屑进行水解，胶原提取率和脱铬率如图2所示。

从图2可以看出，胶原提取率随CaO用量增加而增大，当用量达到8%后趋于稳定。当CaO用量由4%增加至8%时，胶原提取率由14.0%增大至73.5%，增幅为425%；当CaO用量由8%增加至10%时，胶原提取率由73.5%增大至75.8%，增幅仅为3.13%。CaO溶于水生成Ca(OH)2电离出OH-，反应体系中OH-浓度是影响胶原提取率的主要因素。当CaO用量较低时，随CaO用量地增加，反应体系OH-浓度增大，胶原提取率随之增大，但是Ca(OH)2在水中的溶解度不高，随CaO用量进一步增加，部分Ca(OH)2以白色沉淀的形式出现，反应体系中的OH-浓度并不会增加，因此胶原提取率不会随之增加，而是趋于稳定。

从图2可以看出，脱铬率随CaO用量地增加先增大后趋于稳定。当CaO用量为4%时，脱铬率为87.97%；当CaO用量介于8%～10%时，脱铬率趋于稳定，达到99.96%左右，此时胶原蛋白铬含量仅为0.012m g/g，脱铬率为99.96%。CaO的引入必然会使胶原水解液灰分含量增大，因此为保持较高的胶原提取率并避免水解液灰分过多地增大，确定CaO最佳用量为8%。

3.3.2 C aO反应温度对胶原提取率和脱铬率的影响

反应温度直接影响反应速率，在规定时间内反应速率直接影响胶原提取率和脱铬率。在CaO用量为8%，反应时间为5h的条件下，改变反应温度进行含铬革屑水解实验，探讨反应温度对胶原提取率和脱铬率的影响，其结果如图3所示。

从图3可以看出，胶原提取率随反应温度地升高先增大后趋于稳定。当反应温度由60℃升高至70℃，胶原提取率由38.0%增大至74.2%，增幅为95.26%；当反应温度由70℃升高至75℃时，胶原提取率由74.2%增大至76.0%，增幅仅为2.43%。反应温度变高，反应速率增大，胶原提取率表现出快速增大的现象；但温度升至一定值后，反应体系逐渐趋于动态平衡，反应速率逐渐趋于稳定，胶原提取率表现出趋于平稳的现象。

从图3可以看出，脱铬率随反应温度地升高先增大后趋于稳定。当反应温度为60℃时，脱铬率最低，为89.61%，当反应温度介于70-75℃时，脱铬率趋于稳定，达到99.61%左右，此时胶原蛋白铬含量仅为0.018m g/g，脱铬率为99.61%。反应温度越高越易造成Cr3+转化为Cr6+[13]，危害人体健康，故确定CaO最佳反应温度为70℃。

3.3.3 C aO反应时间对胶原提取率和脱铬率的影响

在CaO用量为8%，反应温度为70℃的条件下，改变反应时间进行含铬革屑水解实验，探讨反应时间对胶原提取率和脱铬率的影响，其结果如图4所示。

由图4可以看出，胶原提取率随反应时间地增加先增大后趋于稳定。当反应时间由1 h增加至3 h，胶原提取率由42.0%增大至52.0%，增幅为23.81%；当反应时间由3 h增加至5 h，胶原提取率由52.0%增大至74.2%，增幅为42.69%；当反应时间由5 h增加至7 h，胶原提取率由74.2%增大至76%，增幅仅为2.43%。当胶原提取率达到74.2%时，说明水解反应已经接近终点，再增加时间不会对胶原提取率带来很明显地增长。

由图4可以看出，脱铬率随反应时间地增加先增大后趋于稳定。其中，当反应时间为1h时脱铬率最低，为88.16%；当反应时间介于5～7h时，脱铬率趋于稳定，达到99.56%左右，此时胶原蛋白铬含量仅为0.021 m g/g，脱铬率为99.56%。由于反应时间越长，能耗越大，故确定CaO最佳反应时间为5 h。

综上所述，CaO法水解含铬革屑的最佳作用条件为CaO用量8%，反应温度70℃，反应时间5 h。

图5 酶用量对胶原提取率的影响Fig.5 Influence of protease dosage for collagen extraction rate

图6 酶反应温度对胶原提取率的影响Fig.6 Influence of protease reaction tem perature for collagen extraction rate

图7 酶反应pH对胶原提取率的影响Fig.7 Influence of protease reaction pH for collagen extraction rate

3.4酶法水解条件优化

为进一步提高胶原提取率，采用蛋白酶对CaO水解后的残渣进行二次水解，探讨酶种类、酶用量、酶反应温度、酶反应pH对胶原提取率的影响。

3.4.1 酶用量的影响

改变酶用量进行含铬革屑水解实验，分别探讨中性蛋白酶和碱性蛋白酶酶用量对胶原提取率的影响，其结果如图5所示。

由图5可以看出，胶原提取率随酶用量地增加先增大后趋于平稳。当中性蛋白酶用量由2%增加至4%时，胶原提取率由14.0%增大至20.6%，增幅为47.14%；当中性蛋白酶用量超过4%时，胶原提取率增速明显降低。当碱性蛋白酶用量由2%增加至6%时，胶原提取率由4.0%增大至11.5%，增幅为187.5%；当碱性蛋白酶用量超过6%时，胶原提取率增速明显降低。酶用量较低时，底物浓度大大超过酶浓度，反应速度随酶浓度的增加而增大，但是酶浓度增加到一定值后，酶促反应速率趋近于最大值，趋于稳定。碱性蛋白酶的最佳用量为6%，胶原提取率为11.5%；中性蛋白酶最佳用量为4%，胶原提取率为20.6%，此时胶原蛋白铬含量仅为0.010m g/g。

3.4.2 酶反应温度的影响

蛋白酶对温度较为敏感，在一定温度范围内才能保持较高的活力，温度偏低会抑制酶的活性，温度过高则会导致蛋白酶变性从而失去活力。改变反应温度进行含铬革屑水解实验，分别探讨中性蛋白酶和碱性蛋白酶反应温度对胶原提取率的影响，其结果如图6所示。

从图6可以看出，中性蛋白酶随温度地升高，胶原提取率先增大后降低。当温度为37℃时，胶原提取率最大，达到21.5%。中性蛋白酶只有在37℃时才易溶于水，温度低于或者高于37℃时，会有部分蛋白酶以沉淀的形式存在，反应体系中酶浓度降低，胶原提取率受到限制。碱性蛋白随温度地升高，胶原提取率先增大后趋于平稳。当反应温度由40℃升高至47℃时，胶原提取率由4.0%增大至11.8%，增幅为195%；温度继续升高至50℃时，胶原提取率仅增大至12.2%，增幅仅为3.39%。碱性蛋白酶最佳水解温度为47℃，当温度超过47℃时胶原提取速率明显降低，说明酶的活力受到了抑制。碱性蛋白酶最适反应温度为47℃，胶原提取率为11.8%；中性蛋白酶最适反应温度为37℃时，胶原提取率为21.5%，此时胶原蛋白铬含量仅为0.020 m g/g。

3.4.3 酶反应pH的影响

pH对酶的活力影响很大，在最适的pH条件下才能使酶的作用达到最大，过高或过低的pH都会使酶的空间构象发生改变，从而使酶失去活力。改变反应体系pH进行含铬革屑水解实验，分别探讨中性蛋白酶和碱性蛋白酶反应pH对胶原提取率和脱铬率的影响，其结果如图7所示。

由图7可以看出，中性蛋白酶随pH地升高，胶原提取率先增加后降低。当反应体系pH为7.5时，酶活性达到最佳，胶原提取率最大，达到20.3%，此时胶原蛋白铬含量仅为0.020m g/g。碱性蛋白酶随pH地升高，胶原提取率先缓慢增大，后快速增大。当反应体系的pH为10.0时，胶原提取率为12.0%，胶原蛋白铬含量为0.020m g/g；当pH超过10.0时，胶原提取率表现出快速增大，说明反应体系中OH-成为水解革屑的主要因素，酶活性降低或已失活，含铬革屑在碱的作用下快速水解，同时Cr(OH)3与OH-进一步反应生成水溶性NaCrO2，使得胶原水解液铬含量大幅增加。碱性蛋白酶最适反应pH为10.0，胶原提取率为12.0%；中性蛋白酶最适反应pH为7.5，胶原提取率为20.3%，此时胶原蛋白铬含量仅为0.020 m g/g。

综上所述，中性蛋白酶提取胶原蛋白的效果要好于碱性蛋白酶，最佳作用条件为中性蛋白酶用量4%，反应温度37℃，反应pH 7.5。

3.5 CaO-中性蛋白酶结合法水解

上述3.3、3.4分别对CaO、蛋白酶水解条件进行了优化，得出了CaO、蛋白酶的最佳作用条件。在其基础上，进行“CaO-中性蛋白酶”结合法水解含铬革屑的验证实验，得到含铬革屑在CaO、中性蛋白酶最佳作用条件下，胶原提取率为77.45%，脱铬率为99.71%，胶原蛋白铬含量为0.018m g/g。

4 结论

（1）采用 NaOH、CaO、MgO、NaHCO3水解含铬革屑，CaO最佳，胶原提取率为56.3%，脱铬率为98.38%。

（2）CaO法水解含铬革屑的最佳条件为：CaO用量8%，反应温度70℃，反应时间5h。

（3）中性蛋白酶提取胶原蛋白的效果要好于碱性蛋白酶，最佳作用条件为：中性蛋白酶用量4%，反应温度37℃，反应pH 7.5。

（4）采用“CaO-中性蛋白酶”结合的方法水解含铬革屑，胶原提取率达77.45%，脱铬率达99.71%，胶原蛋白铬含量为0.018 m g/g。

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