基质金属蛋白酶-2在脑胶质瘤细胞中的表达及其分子探针体外磁共振成像的检测

孙艳,沈静,单煜恒,钟士江

(1.中国人民武装警察部队后勤学院附属医院脑科中心，天津 300162;2.中国人民武装警察部队安徽总队医院神经内科)

脑胶质瘤是原发性人脑肿瘤中的一类恶性疾病，罹患者大多不到5年的生存率，恶性程度高。胶质瘤的治疗是世界医学难题。虽然近年来从手术、化疗与放疗等手段治疗脑胶质瘤取得很大进展，但并未显著提高其治疗效果，很大一部分原因是由于其发病部位位于中枢神经系统，且其相当一部分会浸润迁移至外周组织[1]。西医治疗(手术、放疗、化疗)很难达到治愈与控制复发的目的，因此需要了解胶质瘤侵袭的分子机制，特别是其在临床应用的重要价值。

基质金属蛋白酶(MMPs)是一种结构中含有锌离子和钙离子的蛋白水解酶类，主要分解细胞外基质蛋白酶类成分，包括发育、组织塑形、炎症、退行性疾病、肿瘤生长、侵袭与转移、血管生成等生理病理过程。MMP2是基质金属蛋白酶家族中的重要亚型[2]。当过表达MMP2时，能促进不同肿瘤的转移，特别是胶质瘤中的转移情况。因此有关MMP2的研究就显得相当重要。但是有关MMP2和胶质瘤的分子研究和影像学研究还需更进一步的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人U251、U373及大鼠C6胶质瘤细胞系购自于中国医学科学院协和细胞库，星形胶质细胞系(RA)购自于上海中国科学研究院细胞所。

1.1.2 主要试剂与仪器 (1)试剂：BIO-r-C磁性氧化铁纳米颗粒(USPIO)以Fe3O4为核心，pH值呈中性，其Fe的浓度为3.5 mg/mL，购买自北京万德高科技发展有限公司。合成USPIO-PEG-MMP2Ab分子探针由广州锐博生物公司合成。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)、N-羧基琥珀酰亚胺(NHS)；DMEM高糖培养基及FBS胎牛血清(FBS)购于美国Gibco公司；普鲁士蓝染色试剂盒(Perls stain,核固红法)购于康为世纪(北京)有限公司。(2)仪器：电子显微镜(JEM-100CXⅡ，日本)；动态光散射纳米粒度仪(Malvern Mastersizer2000，英国)；酶标仪(Eppendorf，德国)；3.0T磁共振扫描仪(Philip，荷兰)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞的培养、传代和贮藏 人U251、U373及大鼠C6胶质瘤细胞系、星形胶质细胞系(RA)用DMEM/HIGH GLUCOSE培养基(10%FBS，1%双抗，1%谷氨酰胺)培养在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。待细胞铺满瓶底的80%～90%时用胰蛋白酶法消化传代。

1.2.2 免疫印迹 RIPA细胞裂解液提取三种脑胶质瘤细胞及星形胶质细胞的总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，后与蛋白等比例加入SDS Loading Buffer，煮沸10 min，进行电泳并半干转至PVDF膜，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，加入抗MMP2兔多克隆抗体(1：500)及兔抗人β-action抗体(1∶2000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗5次，8 分钟/次，加入含5%脱脂奶粉的封闭液稀释的二抗，室温孵育1 h，TBST洗5次，8分钟/次，滴入显影液，凝胶成像仪下曝光显影并采集图像，以β-actin为内参，实验重复3次，使用Image Lab软件进行数据定量分析。

1.2.3 合成USPIO-PEG-MMP2Ab探针 吸取USPIO-PEG(1 mg，3.5 mg Fe/mL)加入2 mL EP管中，称取1 mg EDC及2.8 mg sulfo-NHS，加入100 μL去离子水溶解后，迅速转移至USPIO-PEG溶液中，在室温下反应15 min，采用PD-10交换柱对活化后的USPIO-PEG进行缓冲液交换，洗脱液采用NaHCO3(0.1 M)，然后加入1mg MMP2Ab在室温下进行偶联反应，4 h后，PBS缓冲液进行透析并过夜，偶联完毕后，将偶联物置于4 ℃冰箱储存备用，使用前用无菌PBS洗2次，1次5 min。

1.2.4 噻唑蓝(MTT)比色法 取对数期生长的RA细胞，以每孔2×104细胞均匀接种至96孔板，完全培养基37 ℃培养24 h，PBS清洗2遍。加入DMEM稀释的USPIO-PEG-MMP2Ab(0、6.25、12.5、25、50、100 μg Fe/mL)，每组设置3个复孔，37 ℃培养24、48、72 h后加入20 μL MTT(5 mg/mL用PBS配制pH=7.4)，继续培养4 h，水平离心机离心后小心弃去上清，每孔加入100 μL二甲基亚砜，避光置于微量振荡器震荡15 min，在酶标仪下读取490 nm处吸光度值。

1.2.5 普鲁士蓝检测 取对数期生长的C6细胞，以每孔5×104细胞均匀接种至24孔板，完全培养基培养24 h，PBS清洗2遍。加入200 μL USPIO-PEG-MMP2Ab、BSA、BSA-USPIO，4 ℃孵育2 h后PBS清洗2遍，4%多聚甲醛室温固定30 min,每孔加入Perls stain 200μL，室温静置30 min后PBS清洗3遍，核固红复染5 min，PBS清洗后显微镜下观察。

1.2.6 体外细胞磁共振成像 取对数期生长的C6细胞，以每孔2.5×105细胞均匀接种至12孔板，完全培养基培养24 h，PBS清洗2遍。加入DMEM稀释的USPIO-PEG及Ab-MMP-2-USPIO(10、20、30、40、50 μg Fe/mL)500 μL，另设置空白对照组。37 ℃培养2 h后，胰酶消化离心，200 μL 1%的低熔点琼脂糖溶液重悬后加入96孔板中，迅速置于4 ℃得到细胞均匀分布的琼脂糖凝胶。采用(Philip，Aachieva 3.0T)及人头线圈行轴位及冠状位扫描，扫描参数设置如下。T2WI：TR(repetition time)3000 ms，TE(echo time)15 ms，FOV(field of view)180 mm，层厚1.5 mm，层间距：0.5 mm，矩阵180×142，感兴趣区(ROI)11.5 mm2。每组取不同层面各测量3次，信号强度(SI)下降计算公式如下：SI下降水平=SI空白-SI测定。

2 结果

2.1 Western-Blot检测不同脑胶质瘤细胞系中MMP2表达水平 以RA细胞(0.50±0.21)作为对照，结果显示MMP2在U251(2.19±0.56)、U373(1.65±0.42)、C6(2.31±0.76)均高表达，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

2.2 MTT比色法检测USPIO-PEG及对细胞生存的影响 RA细胞与不同浓度的USPIO-PEG-MMP2Ab(0、6.25、12.5、25、50、100 μg Fe/mL)孵育24 h后细胞存活率见表1。在磁共振应用的有效浓度范围内(≤50 μg Fe/mL)，USPIO-PEG-MMP2Ab对细胞存活率无显著影响，提示其无明显细胞毒性(P>0.05)；当浓度升至100 μg Fe/mL时，细胞存活率显著降低，提示存在一定的细胞毒性(P<0.01)。

表1 MTT检测不同Fe浓度的分子探针对RA细胞存活的影响

注：与Fe浓度为0组比较，aP<0.01

2.3 USPIO-PEG-MMP2Ab与脑胶质瘤细胞的结合

C6细胞与USPIO-PEG及USPIO-PEG-MMP2Ab孵育后的普鲁士蓝染色见图1。细胞内蓝染颗粒较多，主要分布于细胞膜及细胞质中。在相同浓度及孵育时间的条件下，USPIO-PEG-MMP2Ab组的蓝染颗粒较USPIO-PEG组更多、更明显。

图1 USPIO-PEG及USPIO-PEG-MMP2Ab与C6细胞

2.4 USPIO-PEG-MMP2Ab的体外磁共振成像 C6细胞与不同浓度的USPIO-PEG及USPIO-PEG-MMP2Ab(0、10、20、30、40、50 μg Fe/mL)孵育2 h后细胞的SI值均出现下降。在相同浓度下，USPIO-PEG-MMP2Ab组细胞的SI值下降水平明显高于USPIO-PEG组细胞(P<0.01)(见表2)。

表2 C6与USPIO-PEG及USPIO-PEG-MMP2Ab孵育后磁共振成像SI下降值

注：在相同浓度下，USPIO-PEG-MMP2Ab组细胞的SI值下降水平明显高于USPIO-PEG组细胞，aP<0.01

3 讨论

脑胶质瘤约占颅内肿瘤的20%，其生长过快和浸润性较强的特点造成了其预后差[3]。MMPs在恶性肿瘤浸润和转移过程中，参与了细胞外基质和新血管的重构，这主要由于其对底物的亲和性，即胶原Ⅳ，纤连蛋白，蛋白聚糖，他们被分泌出来时是处于未激活状态[4-5]，这一激活过程是通过基质金属蛋白酶或者丝氨酸蛋白酶来完成。恶性肿瘤细胞侵袭性生长需穿过由基底膜和间质成分构成的细胞外基质，基底膜主要由Ⅳ型胶原蛋白构成，而间质则主要由Ⅰ型胶原蛋白构成。绝大部分肿瘤细胞可产生降解Ⅳ型胶原蛋白的酶。近年来肿瘤基因学治疗的发展随着分子生物学技术的发展亦有较大进步。有研究报道MMP9和MMP12参与肿瘤的转移[6-8]。胶质瘤的形成和转移与基质金属蛋白酶家族中的MMP2有关，但是有关MMP2在胶质瘤中的分子机制还未被研究[9-10]。MMP2参与肿瘤的分子机制可能是通过：(1)通过降解癌细胞或者癌巢周围细胞外基质，为癌细胞生长和转移停工良好的环境；(2)在降解细胞外基质的的同时促进血管表皮生长因子，转录生长因子等的释放，通过释放这些血管生长和细胞转录的因子进而到促进癌细胞生长的目的[11-12]。最近有文献报道MMP2和MMP9与脑出血有关系，该研究表示MMP2/MMP9可能促进了出血后血管源性脑水肿的形成[13-14]。但是其模型是在诱导小鼠形成水肿基础上进行研究的，所以在临床上具有一定的参考价值，并没法说明其实用性。MMP2在影像学中的研究多集中在其是否在临床患者中的表达情况，其具体研究机制还未清楚。

本实验首先证实了在多种胶质瘤细胞系(包括人源性和鼠源性胶质瘤细胞系)中，均高表达MMP2，但是在对照组星形胶质细胞系中其表达明显低于其他肿瘤细胞，统计分析发现差异有统计学意义(P<0.05)。而后，本研究利用碳二亚胺法将MMP2的抗体与超顺磁性氧化铁纳米颗粒偶联合成新型磁共振分子探针USPIO-PEG-MMP2Ab，且对其细胞活力进行检测，发现其细胞增殖未受影响，紧接着通过普鲁士蓝染色及体外磁共振成像验证了新型磁共振分子探针同MMP2高表达的C6细胞的靶向能力，在与单纯多肽对照组相比，MMP2靶向性更好(P<0.05)。

本研究显示，MMP2在胶质瘤中高表达，分子影像学研究表明USPIO探针对高表达MMP2的胶质瘤细胞具有靶向性，为今后在体实验进一步验证该磁共振分子探针的成像效果，为其应用于脑胶质瘤早期无创性诊断奠定基础。

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