手足口病检测中应用实时荧光定量PCR的应用效果

刘丽，罗滢娟，李琼，罗青，周信云，朱端昊

（吉安市疾病预防控制中心，江西 吉安 343000）

手足口病主要是指由肠道病毒引起的传染性疾病，主要发生于5周岁以下的幼儿[1]，临床症状主要表现为厌食、口痛、低热、手部、足部及口腔等部位出现小溃疡及小疱疹，严重影响患儿的生长发育，大部分患儿在一周内会自行康复，但少数患儿会引起肺水肿、心肌炎及无菌性脑膜炎等并发症现象[2]，严重者甚至出现死亡现象。2014～2016年吉安市辖区内13个县市区送来的疑似手足口病例经过分析发现，发病人群主要集中在5周岁以下的幼儿，且年龄越小发病率越高，发病时间持续在1周以内[3]，患儿发病的主要病原体以CoxA16及EV71感染为主。现阶段的手足口病仅仅是针对已经出现疾病或症状的现象进行医治，不利于患儿的成长及健康发育，因此，有效地检测、预防及控制措施显得尤为重要。

1 资料与方法

1.1 临床资料 了解2014年～2016年吉安市辖区内13个县市区送来的疑似手足口病例标本87例作为观察对象，87例手足口病患儿中男性患儿与女性患儿之间的比例为53:34，年龄1～5岁，平均年龄为（2.15±1.34）岁，其中出现低热症状的患儿为41例，厌食症状的患儿50例，患儿手部、足部及口腔内均出现不同程度的溃疡及疱疹现象。经过实验室检查后发现确诊患儿为87例。

排除标准：存在严重器质损伤及基础性疾病的患儿、不同意进行此次观察的患儿（监护人不同意）及严重精神障碍患儿；纳入标准：患儿年龄在5岁以下、患儿均存在不同程度的疑似手足口病的相关症状。

1.2 方法 实时荧光定量PCR检测：取患儿咽拭子标准进行复温后，按照试剂盒相关操作标准进行操作，分别进行CoxA16、EV、EV71的实时荧光定量PCR检测及RT-PCR扩增及逆转录，采用生物安全柜实时荧光PCR仪ABI7300；试剂盒：肠道病毒RNA检测试剂盒，采用19 μl的检测混合液，标本5 μl，RT-PCR酶1μl反应条件调整为：10min的45℃，15 min的95℃，15 s的95℃、1 min 60℃进行操作，连续循环操作40次。手足口病病原体检测试剂为通用型肠道病毒核酸检测试剂盒，诊断标准为相关试剂盒的核酸检测阳性结果为主。

1.3 观察指标 将荧光定量PCR检测的结果与实验室检查结果进行对比分析，观察实时荧光定量PCR检测的灵敏度、准确性、特异性及阳性率。

1.4 统计学方法 本研究数据均用SPSS 18.0统计软件处理，计量资料采用“x±s”表示，组间比较采用t检验；计数资料用例数（n）表示，计数资料组间率（%）的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR检测及实验室检查对于检测手足口病的阳性率 实时荧光定量PCR检测及实验室检查对于诊断手足口病的检测阳性率比较差异无统计学意义，见表1。

表1 两种检测方式对于手足口病的检测阳性率比较（n）Table 1 Comparison of the positive rates of two kinds of detection methods for hand foot mouth disease(n)

2.2 实时荧光定量PCR检测的灵敏度、准确性、特异性 实时荧光定量PCR检测诊断手足口病的敏感度为95.24%，特异度为75.00%，准确性为93.10%。实时荧光定量PCR检测与实验室检查结果比较见表2。

表2 实时荧光定量PCR检测与实验室检查结果对比Table 2 Comparison of real time fluorescence quantitative PCR detection and laboratory examination

3 讨论

临床报道指出：肠道病毒中的EV71病毒感染的患儿均伴随较为严重的神经系统并发症出现，具有较大的危害力及致死率，而CoxA16感染引起的手足口病预后较好，出现死亡现象及并发症现象的可能性较低[4]。2014～2016年吉安市辖区内13个县市区出现的手足口病病例主要以5周岁以下的男性幼儿为主，且大部分患儿的发病时间集中在5～10月份[5]，发病持续时间为2～7 d左右，其中2～4岁的患儿发病率最高。随着人们生活环境及细菌的滋生等现象，手足口病的发病率呈现逐年增长的趋势，5周岁以上儿童发病率较少[6]，其显著影响了患儿的正常发育及成长。

肠道病毒感染引起的手足口病的潜伏期为一周内左右，患儿出现感染症状后会获得病毒的免疫力[7]，不同型别的病原感染后抗体不存在交叉保护作用[8]，手足口病的分布较为广泛，一年中以夏秋季节较为多见，病毒的隐性感染较强，因此早期的检测及诊断显得尤为重要。酶联免疫吸附试验检测手足口病的检测阳性率较低，且灵敏度不高，具有一定的局限性[9]；而实时荧光定量PCR检测具有以下特点：分析检测过程中由PCR仪完成操作，不需要进行紫外灯及电泳的观察，减少了操作的复杂过程，加快了检测的进程及速度[10]，提高了检测的可靠性，在完全闭管的情况下进行逆转录及扩增反应能有效减少或避免PCR产物的污染现象[7]；实时荧光定量PCR法的检测时间较短，全程只需要3 h左右，将肠道病毒的检测时间大大缩短，为手足口病的诊断提供了相关的实验室手段[11]，为临床治疗中对症治疗提供了参考依据。实时荧光定量PCR检测通过对CoxA16及EV71感染的病例进行对比分析后得知，CoxA16及EV71感染引起的手足口病患儿在临床症状及表现方面的差异较小，但CoxA16感染引起手足口病患儿的预后较好，且病情较轻；而EV71感染引起手足口病患儿的临床症状较为严重，极易导致神经源性肺水肿及脑干脑炎等并发症的出现，严重的患儿甚至存在生命危险，这一结果与临床报道基本一致。因此，采用实时荧光定量PCR检测对于诊断患儿病情及制定治疗方案具有一定的积极作用。本次观察的结果数据显示，采用实时荧光定量PCR检测对于手足口病患儿的检测阳性率明显较高，说明实时荧光定量RCP检测的灵敏度及特异性较高，值得临床检验的推广使用。

综上所述，实时荧光定量PCR在手足口病检测中的应用效果较为显著，能为疾病的预防与控制提供指导性数据。

[1] 李丽琴,钟婧,周林福,等.EV71、CA16及通用型肠道病毒实时荧光定量PCR诊断试剂盒的研发[J].中华实验和临床病毒学杂志,2013,27(3):224-227.

[2] 余雄武,冯琳,潘虹,等.实时荧光RT-PCR法检测手足口病病原体EV71和CA16及临床特点分析[J].中国妇幼保健,2016,31(2):408-410.

[3] 刘芳,李一苇,李晓寒,等.菏泽市2011年手足口病病原学检测分析[J].国际病毒学杂志,2012,19(1):24-26.

[4] 荆成宝,刘婕,赵斌,等.实时荧光定量PCR技术检测患儿手足口病病原体[J].国际检验医学杂志,2013,34(18):2458-2459.

[5] 席里,杨薇斯,许柏华,等.重症手足口病患儿血清中IL-6、TNF-α水平测定的临床意义研究[J].当代医学,2012,18(24):97-98.

[6] 张荣强,侯佩强,倪楠,等.泰安市2010～2012年手足口病不同标本检测结果分析[J].泰山医学院学报,2013,34(4):248-251.

[7] 贾力.实时荧光定量PCR检测EV71肠道病毒在不同类型样本中检测率的分析[J].中华医院感染学杂志,2012,22(5):1092-1094.

[8] 许东亮,聂晓晶,张国成,等.实时荧光定量PCR快速诊断肠道病毒71型感染[J].中华实用诊断与治疗杂志,2012,26(12):1158-1159.

[9] 沈林.心肌酶及免疫球蛋白检测在小儿手足口病患者的临床应用分析[J].当代医学,2016,22(32):44-45.

[10]孙烨祥,李珊燕,赵虹,等.2013-2014年宁波农村地区手足口病病原学流行特征分析[J].中华医院感染学杂志,2016,26(21):4961-4964.

[11]刘海涛,庄国良,王志越,等.荧光定量RT-PCR法检测门头沟区手足口病病原体探讨[J].河北医科大学学报,2012,33(1):62-64.