中波紫外线诱导的提前衰老成纤维细胞中环状RNA的表达及分析

司晨琛 周炳荣 骆丹

[摘要]目的：對于中波紫外线诱导的提前衰老的人类真皮成纤维细胞（UVB stress induced premature senescence，UVB-SIPS），笔者使用基因芯片筛选了其中环状RNA的表达谱。方法：构建UVB-SIPS模型；采用β-gal染色、细胞周期、CCK8（cell counting kit）检测衰老成纤维细胞；基因芯片技术筛选差异表达的环状RNA；聚合酶链式反应验证相关环状RNA；利用Clusterprofiler r package，对上下调基因分别进行KEGG和GO的富集分析。结果：与对照组比较（差异表达倍数≥1.5，P<0.05），共有472个差异表达的环状RNA，其中228个环状RNA上调，244个环状RNA下调。在472个差异表达的环状RNA中随机选择了8个环状RNA进行聚合酶链式反应。其中有5个环状RNA（hsa_circRNA_100797，hsa_circRNA_100686，hsa_circRNA_400036，hsa_circRNA_101755，hsa_circRNA_003794）与基因芯片的结果一致。GO分析显示，UVB-SIPS组细胞中差异表达的环状RNA亲本基因与细胞对紫外线辐射的反应、DNA修复复合物、有丝分裂、微管蛋白结合等注释条目有关；KEGG分析显示，UVB-SIPS组细胞与未处理组细胞相比，差异表达的环状RNA的亲本基因可能参与与衰老相关的细胞周期、p53信号通路、PPAR信号通路等的调节。结论：本研究初步揭示了提前衰老的人类真皮成纤维细胞中环状RNA的表达，可为未来研究光老化发生机制奠定基础。

[关键词]提前衰老成纤维细胞；环状RNA；基因芯片；竞争结合；生信分析；中波紫外线

[中图分类号]R329.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）12-0128-04

The Expression and Analysis of Circular RNA in Fibroblasts Induced by Ultraviolet B

SI Chen-chen，ZHOU Bing-rong，LUO Dan

（Department of Dermatology， the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，Jiangsu，China）

Abstract： Objective CircRNAs expression profiling was screened in human fibroblasts （HFs） with gene chip in our study. Methods The senescence of cells was verified by β-gal staining， cell cycle and CCK8 （cell counting kit）. The differently expressed circRNA ware screened by gene chip.Some circRNAs were tested by qRT-PCR （real-time quantitative polymerase chain reaction） randomly. The Clusterprofiler r package was used to analyse GO and KEGG pathway of up-regulated and down-regulated circRNAs. Results Compared to the control group （fold change ≥1.5，P<0.05）， a total of 472 circRNAs in the UVB-SIPS group were differently expressed. Among them， 228 circRNAs were up-regulated and the other 244 down-regulated. The microarrays of eight circRNAs selected from the 472 differently expressed circRNAs were retested by qRT-PCR. The results of five （hsa_circRNA_100797， hsa_circRNA_100686， hsa_circRNA_400036， hsa_circRNA_101755， hsa_circRNA_003794） were in accordance with their chip results. Go analysis showed that the parent genes of differently expressed circRNA in UVB-SIPS group were related to the annotataion of cellular response to UV， DNA repair complex， mitotic nuclear division， tubulin protein binding and so on. KEGG analysis implicated the parent genes of differently expressed circRNA in UVB-SIPS group may be involved in regulating the pathway of cell cycle， p53 signal pathway， PPAR signal pathway when compared to blank group. Conclusion This study uncovered the profiling of circRNA in premature senescent human fibroblasts for the first time and lay the foundation for studying the mechanism of photoaging.

Key words： premature senescent fibroblasts； circular RNA； microarray； competitive binding；bioinformatic analysis； ultraviolet B

皮膚衰老由内源性衰老和外源性衰老引起，内源性衰老主要指人体的自然衰老，外源性衰老也叫光老化，主要由太阳光照射引起。一些刺激，例如紫外线照射，可引起体外正常细胞提前衰老。人成纤维细胞（human fibroblasts， HFs）能分泌胶原纤维、弹力纤维和一些能促进表皮细胞生长和迁移的生长因子[1]。环状RNA首先于1976年在植物病毒中被发现，一开始它被认为是一类错误剪接且没有研究意义的RNA。其实环状RNA是一类不受核酸外切酶影响，在细胞质中稳定、丰富存在，5'末端和3'末端剪接在一起的非编码RNA[2]。近年来发现环状RNA能调节基因转录和RNA结合蛋白的翻译[3]。此外，环状RNA因能互补结合miRNA进而调节靶向mRNA的作用已经成为研究热点[4-5]。目前已存在一些环状RNA与衰老相关的前期研究[6-7]，但环状RNA在人类衰老的皮肤成纤维细胞中的表达还未得到研究。因此，本研究主要对UVB诱导的人提前衰老的真皮成纤维细胞中环状RNA的表达及潜在功能进行探讨。

1 材料和方法

1.1 材料：人类成纤维细胞取自江苏省人民医院泌尿外科门诊健康男性患者的包皮。该研究已通过南京医科大学第一附属医院的伦理审核且所有受试者均签署了知情同意书。胰蛋白酶和DMEM培养液分别购于美国Amresco公司和美国Gibco公司。胎牛血清购于杭州四季青生物公司。β-gal衰老染色试剂盒和CCK8试剂盒分别购于江苏碧云天公司和美国Bimake公司。Trizol核酸提取液购于美国Invitrogen公司。UVB照射仪购于上海希格玛高技术有限公司（ss-40，波长280～320?m，波峰311nm）。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分离和培养：将包皮放在碘伏中浸泡10min后用含有青霉素、链霉素的PBS反复冲洗3次。分离出包皮的皮下组织，浸泡在含1%青霉素、链霉素的PBS中冲洗。加入适量0.5% Dispase酶消化液，将装有包皮的培养皿放入4℃冰箱中消化18～20h。取出后将表皮与真皮分离，弃去表皮，真皮部分加入0.1%胶原酶I消化液，放入37℃、含5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中消化2h，取出后加入含10%胎牛血清及1%青霉素、链霉素的DMEM培养基，用枪头轻轻反复吹打后使用200目尼龙网过滤；得滤液并将细胞悬液在1 500r/min离心5min，弃去细胞上清液，加入培养液后吹打混匀，放入37℃、含5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中静置，等待细胞贴壁。

1.2.2 UVB-SIPS模型的体外构建：空白对照组：不做任何处理的成纤维细胞；UVB-SIPS组：直接接受UVB照射的成纤维细胞。在UVB-SIPS组中，根据预实验结果来设定UVB的累计照射剂量。UVB的照射方法参考Xu Y等[8]的研究进行。UVB照射前，去除细胞的培养基并换成PBS。通过Waldmann UV meter来检测UVB机器发射剂量的大小。UVB的剂量=UVB的照射强度（mJ）×照射时间（s）。细胞与紫外灯的距离应保持15cm。UVB-SIPS组的细胞接受每天10mJ/cm2，共计5d的UVB照射。照射后静置48h，UVB-SIPS的模型即可建立并用于下一步的研究。

1.2.3 细胞衰老染色：β半乳糖苷酶染色试剂盒可用于检测细胞衰老。操作步骤如下：将细胞固定在2%或者0.2%戊二醛中，15min后用PBS洗净。再将细胞放入配置好的工作液中，于37℃、不含CO2的培养箱中过夜培养后，在普通光学显微镜下观察细胞。

1.2.4 细胞增殖率测定：将UVB-SIPS细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素链霉素、的DMEM培养液中稀释成密度为每微升500个细胞，然后以每孔4?l共2 000个细胞接种至96孔板内，24h后在光学显微镜下观察细胞生长情况。去除原始培养液，每孔加入10?l CCK8溶液和90?l DMEM培养液。在含5% CO2饱和湿度的培养箱中孵育1h，在450nm吸光度下用酶标仪检测OD值。

1.2.5 细胞周期检测：在最后1次UVB照射3d后，用0.125%胰蛋白酶消化细胞，当细胞被消化下来时加入培养液，用离心机进行1 500r，5min的离心。去除上清液，用1ml冰PBS重悬细胞。向-20℃ 3ml无水乙醇中缓慢滴入重悬的细胞，轻轻吹匀。用流式检测仪进行检测。

1.2.6 RNA提取、准备及芯片技术：用于提取和纯化总RNA的试剂分别是：Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）和MirVana miRNA分离试剂盒（Ambion，Austin，TX，USA），琼脂糖凝胶电泳用于检测RNA的完整性。使用基因芯片技术进行检测。

1.2.7 生信分析：利用Clusterprofiler r package，物种选择为人类，对上下调基因分别进行KEGG和GO的富集分析。将P<0.05设置为筛选条件，按照P值，由小到大进行筛选。

1.2.8 统计学分析：使用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，检测数据均以（x?±s）表示，采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 衰老成纤维细胞的验证：UVB-SIPS组β-gal染色阳性率为（28.6±0.031）%，而对照组阳性率是（10.5±0.021）%。两组比较，差异有有统计学意义（P<0.05）；细胞周期显示：UVB组细胞与对照组相比，G1期明显受阻滞，S期减少，差异有统计学意义。（对照组G1期：48%，UVB组G1期：55%，P<0.05）；UVB-SIPS组细胞CCK8检测的OD值为（0.891±0.097），与空白对照组（OD值1.200±0.123）比较，差异有统计学意义（t=4.82，P<0.05），说明UVB-SIPS组的细胞增殖活力低于对照组。细胞验证结果见图1。

2.2 UVB-SIPS组中环状RNA表达谱：基因芯片检测并筛选出782个差异表达的环状RNA，其中有472个与对照组相比差异表达倍数FC≥1.5， P<0.05。在这些环状RNA中，228个上调，244个下调。上调最显著的是hsa_circRNA_101266，差異表达倍数FC=7.0704， P=0.00057；最显著下调的是hsa_circRNA_089761，差异表达倍数FC=14.81， P=0.00778。层次聚类图、火山图和散点图都定性揭示了UVB-SIPS组中环状RNA的差异表达情况。见图2。

2.3 差异表达的环状RNA聚合酶链式反应：在芯片筛选出的差异表达的环状RNA中，随机选择8个差异表达的环状RNA进行实时定量PCR。PCR结果显示hsa_circRNA_400036，hsa_circRNA_101755， hsa_circRNA_003794在UVB-SIPS中上调，hsa_circRNA_100797， hsa-circRNA_100686在UVB-SIPS中下调。然而，hsa_circRNA_101911和hsa_circRNA_102442的PCR结果与芯片结果不符合。hsa_circRNA_003781的差异表达量无意义。见图3。

2.4 生信分析：GO分析显示，UVB-SIPS组细胞与未处理组细胞相比，上调的环状RNA的亲本基因主要与细胞对辐射的反应、DNA损伤复合物、泛素蛋白连接酶等富集条目有关；下调的环状RNA的亲本基因在有丝分裂、DNA组装复合体、微管蛋白结合等方面可能有一定作用。KEGG分析显示，UVB-SIPS组细胞与未处理组细胞相比，差异表达的环状RNA的亲本基因参与与衰老相关的细胞周期、p53信号通路、PPAR信号通路等的调节。

3 讨论

环状RNA是一种非编码RNA且在真核生物转录组中占总RNA95%的非常重要的基因调控者。环状RNA由mRNA在5 '末端和3'末端剪接后连接而成。环状RNA除了可充当miRNA海绵外，还可以通过参与基因转录和蛋白质翻译来调节miRNA功能[9]。笔者研究首次揭示了UVB-SIPS中差异表达的环状RNA的表达谱。通过基因芯片筛选出的差异表达的环状RNA，随机选择了8个进行实时定量PCR验证它们的差异性。其中，5个环状RNA的聚合酶链式反应结果显示与基因芯片一致。许多基因的表达受到温度、试验方法、样品提取时间的影响，另外芯片的结果与聚合酶链式反应比较准确性相对较低。刘腾飞[10]的研究发现在衰老的拟南芥叶子中，环状RNA是上调的。而另一篇文献[2]发现环状RNA在老化的小鼠脑组织中也是上调的。在我们的研究中，总共检测出782个环状RNA，包括228个上调及244个下调的环状RNA。但是，在随机筛选的并通过聚合酶链式反应验证的8个环状RNA中，3个下调而4个上调。大多数与衰老有关的环状RNA总体呈上调趋势。我们猜测可能由于衰老的组织中，环状RNA有积聚倾向，进而导致其在组织中上调。芯片结果中上调最明显的环状RNA是hsa_circRNA_101266，与正常细胞相比的差异倍数是7.07；下调最明显的环状RNA是hsa_circRNA_089761，与正常细胞相比的差异倍数是14.81。UVB-SIPS芯片检测的环状RNA的差异表达倍数并不像癌症[11]中那么明显，可能因为癌症是一种病理过程并受到药物刺激的影响，而由于UVB照射引起的皮肤衰老是一种柔和的慢性生理过程。

GO分析和KEGG分析提示UVB-SIPS组细胞在细胞生物过程、细胞组分和分子功能方面更具衰老倾向。GO分析显示，UVB-SIPS组细胞与未处理组细胞相比，上调环状RNA的亲本基因主要与细胞对紫外线辐射的反应、DNA双链松解、泛素蛋白连接酶、氧化还原酶活性等和细胞老化相关的注释条目有关；同样的，下调的环状RNA的亲本基因与有丝分裂、DNA组装复合体、核糖体亚基组成、转化生长因子β等影响细胞增殖的注释条目相关。KEGG分析显示，UVB-SIPS组细胞与未处理组细胞相比，差异表达的环状RNA的亲本基因参与和衰老相关的细胞周期、p53信号通路、PPAR信号通路等的调节。

综上所述，本研究揭示了人类UVB-SIPS中差异表达的环状RNA的一个总体表达水平。它们对皮肤成纤维细胞衰老的调节作用值得进一步研究。

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[收稿日期]2018-07-30 [修回日期]2018-09-10

编辑/贾敏