猪源莫拉菌的分离鉴定与部分生物学特性分析

廖倡宇，张鹏飞，王 印，*，杨泽晓，姚学萍，姜睿姣，邬旭龙， 张 博， 周丽军，宋 勇

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130； 2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130； 3.天津瑞普生物技术股份有限公司，天津 300300)

莫拉菌属(Moraxella. ap.)是一类成对状或短链状的革兰阴性菌，短且宽，接近球状。卡他莫拉菌属发现于1896年，当时称卡他微球菌(MicrococcusCatarrhais)，是上呼吸道的正常菌群之一。过去人们一致认为无致病性，但近年来研究表明，该菌可寄生于人和其他温血动物黏膜，是一种条件致病菌，当机体免疫力下降时，可单独或与其他细菌共同引起急性中耳炎、鼻窦炎、支气管肺部感染，以及脑膜炎、心内膜炎和败血症等各种感染[1]。所导致的感染为多点散发，偶可引起医院内暴发，卡他莫拉菌是急性中耳炎、鼻窦炎、慢性气管炎急性发作和社区获得性肺炎最主要的致病菌之一，也是小儿脑膜炎及菌血症的常见病因，引起了广泛临床关注[2]。该菌可产生穿孔毒素，引起黏膜和结膜病变，具有传染性[3]。其中，牛莫拉菌可引起牛传染角膜结膜炎，亦称牛红眼病(IBK)[4]；该病在美国常见的牛病中居第二位，造成巨大的经济损失，而且全球均有发生[5]。该菌已从兔[6]、骆驼[7]、犬[8]、山羊[9]、绵羊[10]、豚鼠[11]等多种动物分离得到。近年来从患有脑膜炎、心内膜炎的病猪中分离的莫拉菌数量呈上升趋势[12-14]。

2016年11月，从四川某地送检2 头仔猪，症状主要为发热，食欲减低，呼吸急促，眼睑有轻微肿大；病理剖检发现胸腔大量积液，同时心脏上附着有少量伪膜。剖检主要表现为胸膜炎症，与副猪嗜血杆菌病理症状相似，PCR检测圆环2型病毒核酸为阳性。故本研究采用常规的微生物实验技术，通过纯化分离、生化试验、16S rDNA扩增测序、动物试验、药敏试验以及3种耐药基因的PCR扩增分析。对送检的病料进行检测，为该病的临床诊断、药物治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病料和试验动物

临床样品采集自四川省某猪场2 头猪的病变心脏； SPF健康昆明鼠18～22 g(购自四川达硕生物科技公司)。

1.2 主要试剂

营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、绵羊鲜血平板、药敏纸片及微量生化反应管均购自杭州微生物试剂有限公司；2×TaqPCR Master Mix、DNA分子量标准、凝胶回收试剂盒等均购自成都擎科生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 细菌分离

无菌采集病料样品接种于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基，37 ℃恒温培养48～72 h后观察细菌生长状况，挑菌后革兰染色镜检，通过平板划线法进行细菌纯化，并用鲜血平板鉴定其溶血性。

1.4 形态学观察与生化鉴定

挑取单菌落接种于已添加5 μL生长因子NAD的微量生化管中，37 ℃培养48～72 h，参照《常见细菌系统鉴定手册》[15]和《伯杰细菌鉴定手册》[16]进行生化特性鉴定。

1.5 16S rDNA的扩增及序列测定

利用试剂盒提取细菌基因组DNA，放置于-20 ℃备用，作为PCR模板。PCR反应体系40 μL: 2×TaqPCR Master Mix 20.0 μL，ddH2O 10.0 μL，上、下游引物各3.0 μL(表1)，模板DNA 4.0 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，34个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR产物纯化后，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.6 系统发育树的构建

PCR扩增产物测序后获得菌株的16S rDNA序列，将该序列在GenBank上采用BLAST进行比对，确定种属范围。选取同属不同动物源性的部分菌株16S rDNA序列用DNAstar软件进行同源性分析，使用MEGA 5.1软件对其运用邻近法(neigh-bour joining)构建进化树(phylogenetic tree)。

1.7 小鼠致病性试验

参照改良寇氏法，分离菌株接种到胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基中，37 ℃培养48 h后，将菌液浓度调整为1×109cfu·mL-1的细菌悬液。选择用无特定病原体小鼠(SPF小鼠)(每只18～22 g)，每组5 只，设立5 组，腹腔注射每只注射0.2 mL的菌液；同时设立对照组，注射等量的无菌生理盐水。

1.8 药敏试验

参照CLSI推荐的琼脂扩散法(K-B)进行分离株的药物敏感试验。

1.9 耐药基因PCR检测

选取了β-内酰胺酶类Tem-1、DHA-1两种耐药基因和耐受碳青霉烯类药物的耐药基因OXA-48，并分别使用相关特异性引物(表1)进行耐药基因的PCR检测。反应体系40.0 μL: 2×TaqPCR Master Mix 20.0 μL，模板4.0 μL，上下游引物各1.5 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，34个循环；72 ℃延伸10 min。对PCR阳性扩增片段进行胶回收，转化至DH5α感受态细胞中，将产物送成都擎科生物科技有限公司测序，将测序结果进行BLAST分析。

2 结果与分析

2.1 菌体形态观察

菌株ZY20001在普通平板生长不良，麦康凯平板不生长， TSA生长较好， 40 h以上方可见明显菌落。该菌的菌落圆润，半透明，光滑，隆起，菌落直径1～2 mm，无溶血性。革兰染色镜检为革兰阴性菌，短杆状，一般成对状排列(图1)。

2.2 PCR扩增结果和进化树分析

将挑取的ZY20001菌落进行PCR扩增，大小约为1 400 bp(图2)。将其16S rDNA测序结果进行BLAST比对分析，发现与莫拉菌(GenBank登录号GU226327.1)同源性高达99%。在NCBI上选取不同来源的莫拉菌(表2)16S rDNA序列，通过DNAstar比对同源性，发现ZY20001与Moraxellasp.(GenBank登录号：GU226327.1)和(GenBank登录号：NR_042666.1)同源性高达99.5%(图4)。通过MEGA 5.1进行序列比对，发现该株莫拉菌与猪源分支莫拉菌同源性最高(图3)，该分支与其他动物源分支莫拉菌为并列关系。

表2试验用引物序列

Table1Primer sequences used in this experiment

基因名称Genename引物序列Primersequence(5'-3')片段长度Productslength/bp扩增基因名称Amplifiedgenename16SrDNAP1:AGTTTGATCCTGGCTCAG150016srDNAP2:TTACCTTGTTACGACTOXA-48P1:CTTTCACAGGTGTGCTGGGT743碳青霉素烯酶P2:GTACGCATACTGGCTTTGCCarvapenmaseDHA-1P1:CTTTCACAGGTGTGCTGGGT405产头孢菌素内酰胺酶P2:GTACGCATACTGGCTTTGCAmpCbeta-lactamaseTEM-1P1:AAATTCTTGAAGAC1075产超广谱内酰胺类酶P2:CCAATGCTTAATCAExtendedspectrumbeta-lactamases

试验用引物序列参照文献[17]， 引物由成都擎科生物科技有限公司合成。

Test primer sequences were designed according to the literature [17]. Primers were synthesized by Chengdu Tsingke Biotechnology Technology Limited Engine.

图1 革兰染色结果(10×100)Fig.1 Result of Gram staining (10×100)

2.3 细菌生化特性

分离菌经48～72 h生长后，触酶阳性；V-P试验、MR试验、H2S试验、鸟氨酸脱氢酶、运动性、葡萄糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、七叶酸水解阿拉伯糖、D-葡萄糖产酸产气，0%和1%的NaCl均为阴性。与《伯杰细菌鉴定手册》描述的莫拉菌属部分菌株的部分生化特性相同，该菌生长需要的营养要求较高。普通的单一的营养成分基本无法适应其生长。

2.4 小鼠致病性试验

注射菌液12 h左右，小鼠出现精神不振，部分小鼠停止进食。24 h后，随机选取部分精神状态不佳的小鼠剖检，未发现典型的病变特征，48 h剖检精神状态不佳小鼠，发现小鼠心包少量积液(约0.03 mL)，无伪膜。无菌蘸取积液接种于TSA平板，进行分离纯化，经过细菌分离鉴定后再次分离到该菌。96 h后，剩余的小鼠开始逐步进食，饮水。1周内所有小鼠逐步恢复，试验期间，未见死亡。

2.5 细菌的药敏试验

通过对ZY20001菌株的药敏试验，发现其对庆大霉素，阿米卡星等16种抗生素敏感，对奥复星，多粘菌素B等5种抗生素中度敏感，对哌拉西林耐药(表4)。

M， DL 2000分子质量标记； 1， 16S rDNA扩增结果； 2， 阴性对照。M， DL 2000 marker； 1， 16S rDNA amplification results； 2， Negative control.图2 16S rDNA扩增结果Fig.2 16S rDNA amplification results

2.6 耐药基因PCR扩增结果

对分离菌株ZY20001进行3种耐药基因的PCR检测，结果显示(图5)，Tem-1基因条带阳性，长度为1 075 bp。OXA-48耐药基因和DHA-1耐药基因PCR扩增为阴性。根据药敏结果显示，该菌对青霉素高度敏感，但该菌又含有Tem-1耐药基因。可见含有耐药基因不一定会表现出该基因的耐药表型。

表2菌株说明

Table2Strain description

菌株Strains登录号Accessionnumber来源Source地区RegionsSN10-2MGU226327.1猪Porci西班牙Spain248-01NR_042666.1猪Porci西班牙SpainCD12CA4EF396294.1猪Porci西班牙SpainSN9-4MNR_116918.1猪Porci西班牙SpainCCUG_2154NR_041695.1兔Cunculi瑞典SwedenCCUG2154TAF005188.1兔Cunculi瑞典SwedenMOR44FM244731.1骆驼Camel比利时BelgiumMOR43FM244730.1骆驼Camel比利时BelgiumATCC25238TAF005185.1人Homosapiens瑞典SwedenNe11NR_028669.1人Homosapiens瑞典SwedenATCC25238NR_118775.1羊Ovis瑞典SwedenATCC33078TAF005186.1羊Ovis瑞典Sweden199/55NR_028670.1羊Ovis瑞典SwedenSp346JN001947.1牛Calf乌拉圭UruguaySJ03BJN001946.1牛Calf乌拉圭UruguayFs328JN001948.1牛Calf乌拉圭UruguayN7NR_028914.1犬Canis美国USALMG11194TAJ269511.1犬Canis比利时Belgium

图3 16S rDNA进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA

图4 16S rDNA同源性Fig.4 Homology of 16S rDNA

表4分离株药物敏感性试验结果

Table4Drug sensitivity test results of isolates

药物Drug剂量Dose/μg抑菌圈直径Diameter/mm敏感度Sensitivity庆大霉素Gentamicin1026S阿米卡星Amikacin2024S卡那霉素Kanamycin3016S四环素Cyclomycin3027.5S青霉素Penicillin10U24S哌拉西林Piperacillin1000R头孢曲松Ceferiaxone3024S头孢哌酮Cefoperazone7525S头孢氨苄Cefalexin3023S奥复星Ofloxacin518I多西环素Doxycycline2425S诺氟沙星Norfloxacin1014I环丙沙星Ciprofloxacin518I氟苯尼考Florfenicol3020S左氧氟沙星Levofloxacin524S恩诺沙星Enrofloxacin1020S多粘菌素PolymyxinB3014I复方新诺明Cotrimoxazole23.7516I呋喃唑酮Furazolidone30024S红霉素Erythromycin1540S头孢曲松Rocephin3020S麦迪霉素Mydecamycin3020S

S为敏感； I为中度敏感； R为耐药。

S，Sensitive; I， Intermediary; R， Resistance.

M， DL 2000分子质量标记； 1、2、3分别为Tem-1，OXA-48，DHA-1； Tem-1长度是1 075 bp。M， DL 2000 marker. 1， 2， 3 were Tem-1，OXA-48，DHA-1，respectively. The length of Tem-1 is 1 075 bp.图5 ZY20001部分耐药基因PCR扩增产物的琼脂糖检测Fig.5 Agarose detection results of ZY20001 partial resistance gene PCR amplification products

3 讨论

国内外对猪源莫拉菌研究较少，但近年来，分离出的致病猪源莫拉菌呈现上升趋势，国内却未见报道。本研究所分离的猪源莫拉菌国内尚属首例。

由于国内尚无对猪源莫拉菌较为系统的划分，故本研究将部分莫拉菌属的16S rDNA序列按动物源将莫拉菌进行分型，发现猪源莫拉菌是属于莫拉菌的一个亚种，与牛源莫拉菌、兔源莫拉菌、犬莫拉菌、卡他莫拉菌一样，形成一个独立的分支，这与Vela等[14]的研究结果一致。实验过程中发现，猪源莫拉菌对营养要求较高，生长周期较慢，40 h左右才出现明显的菌落，对兽医临床常用抗生素表现不同程度的敏感，在环境中极易死亡[3]。故临床样本中极少能分离出该菌。

菌株ZY20001对21种抗生素表现出不同程度的敏感性。菌株ZY20001具有TEM型β-内酰胺酶基因，药敏试验结果显示对青霉素敏感，其耐药的表型与基因型不符，菌株ZY20001具有潜在抗药性。由于环境和遗传调控着抗生素耐药性表型表达，已有研究表明，过长的生长周期将导致β-内酰胺类的抗生素药效降低。该菌生长周期较缓慢，但菌株ZY20001依然表现明显的敏感性，并且对多种抗生素表现出敏感，极有可能是菌株ZY20001摄取抗生素的能力较强，即使细菌产生β-内酰胺酶，但是酶尚不足以完全作用于进入菌体的青霉素。在某些情况下，例如在PhoPQ系统中，脂质A的改变，其降低负电荷并且导致阳离子肽静电排斥到细胞表面。这与生物膜中观察到的另一个常见的反应类似：多重耐药外排泵的增加，增加抗生素的外排或降低的抗生素摄取的能力，这些功能与代谢活性降低或膜的成分变化有关[19]。综上，可能是菌株ZY20001的TEM型β-内酰胺酶的耐药基因位点发生突变、耐药基因水平转移等因素导致或该菌具有较强的抗生素摄取的能力。

莫拉菌属作为一类条件致病菌，主要侵袭部位为人和动物的黏膜。受感染的患畜多伴有黏膜部位或结膜部位的炎症，在一定条件下可引起仔猪的全身感染。本研究表明，猪源莫拉菌对营养要求较高，对环境的耐受较差，该菌对多种抗生素敏感，这可能也是该菌引起的相关疾病偶有发生，未大面积出现的重要原因。该菌含有TEM型β-内酰胺酶基因，却少见地表现出对青霉素敏感。可见，有TEM型β-内酰胺酶基因并不一定会表现出青霉素耐药，这为猪源莫拉菌的临床用药和进一步耐药机理研究提供了科学依据。

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