DDR相关蛋白缺陷引起的原发性免疫缺陷表型研究进展

曾宪思，贾金婧，陈 磊，余亚军，宋新强

(1.信阳师范学院a.生命科学学院; b.大别山农业生物资源保护与利用研究院, 河南 信阳 464000；2.信阳市林业工作站，河南 信阳 464000)

0 引言

外源性刺激或内源性压力可以导致DNA双链断裂(DNA double strand break，DSB).在细胞自身调控过程中还存在程序性DSB，如可变区基因(多样化基因)连接区基因片段重组(variable(diversity)joining recombination，V(D)J)和类别转换重组(class switch recombination，CSR)均可产生程序性DSB.DSB是最严重的DNA损伤类型.细胞在应对DNA损伤时会启动DNA损伤反应(DNA damage response，DDR)，包括DNA损伤部位的检测、DNA损伤信号的传递与DNA损伤修复系统的启动即启动非同源末端连接途径(non-homologous end joining，NHEJ)修复DNA损伤.

DDR对维持正常的细胞功能至关重要，DNA双链断裂被正确修复后细胞可以存活，被错误修复将导致染色体畸变或易位，这种含有DNA损伤的病变细胞可发展为恶性肿瘤.程序性DDR障碍将导致原发性免疫缺陷(primary immunodeficiency，ID)[1].DNA损伤信号或NHEJ缺陷的病人具有PID表型，包括放射敏感性、恶性肿瘤易感性、发育迟缓与神经功能缺损[2].这些疾病使我们认识了每一DDR相关蛋白的生理意义和功能.本文将介绍V(D)J重组与CSR产生程序性DDR的分子机制，以及DDR相关蛋白缺陷导致的PID表型.

1 V(D)J重组与CSR重组产生DDR的分子机制

1.1 V(D)J重组

V(D)J重组是发生在免疫球蛋白与T细胞受体的DNA重排过程，对B淋巴细胞和T淋巴细胞的发育至关重要.为了应对外来抗原，淋巴细胞将产生大量的抗原受体，包括B细胞受体和T细胞受体.这些受体可变域即抗原结合域的编码基因是由彼此分离的2或3个基因片段(VJ或VDJ)通过V(D)J重组组装而成，而V、D和J片段本身具有不同的拷贝，因此通过V、D、J基因片段的重组或V、J基因片段的重组可使抗原受体呈现多样性.淋巴细胞特有的重组酶RAG1/2与每一个即将发生重排V、D、J片段两端的重组信号序列(recombination signal sequences，RSS)结合，催化基因片段本身和RSS之间的双链DNA断裂，最后通过NHEJ将断裂的DNA末端连接起来[3].当发生DSB时，B细胞受体或T细胞受体基因编码区末端形成共价封闭的DNA发卡结构，DNA依赖的蛋白激酶(DNA dependent protein kinase，DNA-PK)的调节亚基Ku70/80与DNA-PK催化亚基(DNA-PK catalytic subunit，DNA-PKcs)结合在发卡结构上，形成具有全酶活性的DNA-PK；然后，募集Artemis与DNA-PKcs形成复合体.DNA-PK磷酸化Artemis，活化的Artemis具有核酸内切/外切酶活性可打开发夹结构.DNA损伤信号分子在这种程序性DDR中也具有重要作用.ATM与MRE11-RAD50-NBS1复合物(MRN)募集在DNA断裂位点并启动DDR信号[4,5].环指蛋白168(ring finger protein168，RNF168)与p53结合蛋白1(p53-binding protein 1，53BP1)也可以促进DDR，RNF168可以对53BP1进行泛素化修饰[6].最后，DNA连接酶IV/XRCC4-XLF复合物通过NHEJ修复DSB[7].

1.2 CSR重组

免疫球蛋白的类别转换重组(class switch recombination，CSR)发生在其重链的恒定区，Cμ被 Cγ、Cα或 Cε取代后形成IgG、IgA与IgE.B细胞可以进行CSR即Ig重链区被另一个Ig区所取代，使B细胞产生不同的Ig亚型.活化诱导的胞苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase，AID) 可以将转录活化的S区的胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶并启动CSR.引入的尿嘧啶被尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil-DNA glycosylase，UNG)修饰并通过碱基切除修复途径切除，脱碱基位点被脱嘌呤/脱嘧啶核苷酸内切酶切割产生DNA单链断裂(single strand break，SSB)，SSB随后转变为DSB.错配修复也可以通过MMR复合物(MSH2、MSH6、MLH1、PMS2与 EXO1)产生DSB.Sμ/Sx突触由ATM/MRN/53BP1/RNF168/γ-H2AX修复后，随后通过与V(D)J重组最后过程相同的机理进行修复[8].CSR过程尽管不形成发卡结构，但也需Artemis参与[9].

2 V(D)J重组中DDR相关蛋白缺陷及其引起的表型

2.1 ATM缺陷

ATM激酶通过磷酸化多种DDR分子在DDR中发挥核心作用.ATM激酶不仅可以修复DSB、调节细胞周期、决定细胞命运，还参与转录调控、端粒与线粒体维持、无义介导的衰变与自噬.ATM缺失会导致体细胞同源修复缺陷，抑制ATM活性则显著降低同源修复[10].ATM激酶缺陷与染色体破碎增加密切相关，导致易患白血病等恶性肿瘤[11].ATM突变可引起共济失调毛细血管扩张症(ataxia telangiectasia，A-T).A-T是一种常染色体隐性遗传并涉及多系统病变的神经退行性疾病，其主要特征为早发性共济失调、毛细血管扩张以及恶性肿瘤发病率增加[12].A-T最显著的临床表现是放射敏感性.大约30%的A-T患者表现出免疫缺陷，如由V(D)J重排效率降低与新生T细胞减少引起的T细胞数目减少.A-T患者中通常发生血清α-胎蛋白减少、7号染色体与14号染色体的易位等变化.

2.2 MRN复合物缺陷

在DDR信号中，MRE11、RAD50和NBN(NBS1)形成复合物结合DSB通过激活ATM激酶引发细胞周期检验点,从而在DNA修复中发挥功能，每一组分对稳定复合物的形成至关重要，但在免疫反应尤其是V(D)J重组与CSR中的功能却各不相同.MRE11缺陷患者表现出共济失调性毛细血管扩张症样障碍，如共济失调、小脑萎缩和眼睛不适，但不发生毛细血管扩张.MRE11缺陷患者并未出现免疫学异常，但易患恶性肿瘤[13].NBS1的磷酸化状态决定端粒DNA的修复选择[14]，NBN缺陷可以导致奈梅亨断裂综合征(Nijmegen Breakage syndrome，NBS)，即染色体不稳定综合征，特征为小头症、鸟样脸、生长迟缓、轻度智力低下、免疫缺陷和癌症高发.免疫学研究表明几乎一半的淋巴细胞明显减少的患者伴有轻度或重度的白细胞减少.T细胞绝对数量降低的大部分患者伴有CD4+T细胞的减少，且四分之三的NBS患者出现了B细胞减少.RAD50的ATPase活性是MRN复合物的催化核心之一，受DNA末端调控[15]，其缺陷可以导致与NBS相似的表型，如小头症、智力迟钝、鸟样脸与身材矮小，但淋巴细胞数量和免疫球蛋白表达水平均正常[16].

2.3 RAG1/2缺陷

RAG1/2在V(D)J重组中具有重要作用，其突变将导致B细胞与T细胞缺陷,并表现出B-T-NK+重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)表型.用RAG1免疫缺陷患者的诱导多能干细胞模拟PID可改变T细胞的发育[17].重组活性部分丧失的患者表现出多种表型，如Omenn综合征(Omenn syndrome，OS)，该病的早期临床表现为红皮病、肝脾肿大、淋巴结肿大、脱发、常伴嗜酸性粒细胞与血清IgE升高.据报道，在常见变异型免疫缺陷病与IgA缺乏症的病人中存在RAG1的次形态突变[18].尽管RAG1/2缺陷的SCID患者对放射不敏感，也没有表现出发育延迟，但确诊后就需要尽快进行造血细胞移植.

2.4 Artemis缺陷

核酸酶Artemis对B淋巴细胞和T淋巴细胞的发育至关重要，其C-端和催化结构域的生理相互作用可介导自身活性抑制[19].DNA-PKcs 与ATM可以磷酸化Artemis，但其活化主要由DNA-PKcs所催化.Artemis编码基因DCLRE1C缺陷表现出B-T-NK+放射敏感型SCID[20].DCLRE1C突变通常发生在N-末端区域导致其核酸酶活性丧失.DCLRE1C启动子前存在假DCLRE1C基因，由野生型DCLRE1C与假DCLRE1C基因之间的同源重组引起外显子1-3或1-4的缺失是最常见的突变.DCLRE1C的次形态突变可引起非典型SCID、OS、高IgM综合征等表型，然而Volk等研究证明Artemis突变仅导致抗体缺陷[21].Artemis缺陷的病人易患淋巴瘤.与LIG IV缺陷或XLF缺陷相比，Artemis缺陷的放射敏感性并不显著，且患者没有出现生长迟缓或神经功能缺损等症状.

2.5 DNA连接酶IV (LIG IV) 缺陷

DNA连接酶IVA(DNA ligase IV，LIG IV)是DNA连接酶家族成员之一，参与V(D)J重组过程中DSB的修复，可激活Artemis 的核酸酶活性[22].LIG IV缺陷最初在白血病患者中发现，且化疗对该患者具有严重副作用.随后，在小头畸形、生长迟缓、全血细胞减少和不同程度免疫功能障碍的患者中也发现了LIG IV缺陷.这些病人的表型介于正常人与B-T-NK+放射敏感的SCID之间.LIG IV缺陷后引起的常见症状包括生长不足、严重的小头畸形、全血细胞减少且易患淋巴恶性肿瘤[23].LIG IV的错义突变使其活性降低并表现出联合免疫缺陷.患者随着B、T和NK细胞的减少而呈现出广泛的免疫学异常.

2.6 XLF(NHEJ1)缺陷

在NHEJ中，XLF与XRCC4-LIG IV相互作用激活其连接酶活性进行损伤修复，由于XLF是LIG IV复合物的一个组成部分，因此推测XLF在V(D)J重组中具有重要作用.XLF基因突变可导致端粒酶基因表达降低和端粒变短[24].XLF可以引起N-核苷酸的插入从而产生受体多样性[25].在放射敏感性SCID与血细胞减少的患者中发现了XLF缺陷，导致造血干细胞损伤与早衰并引起血细胞减少[26].XLF突变病人小头畸形、淋巴球减少、生长阻滞，并表现出免疫缺陷和放射敏感性[27].然而，与其他SCID相比，XLF对免疫系统的影响相对较小.最近研究表明XLF不是V(D)J重组必需的.XLF缺陷小鼠一种新的NHEJ因子PAXX可促进Ku在DSB处募集修复损伤[28].RAG蛋白除了识别并结合RSS以外，在断裂末端的解离与重接中也具有重要作用.XLF缺失时，RAG复合物在DSB修复中起辅助作用[29].

2.7 PRKDC(DNA-PKcs)缺陷

DNA-PK由DNA-PKcs和Ku70/80组成，在NHEJ DNA修复途径中发挥重要作用[30].DNA-PKcs与Ku70/80在人体内含量丰富，它们在基因组稳定性的维持中可能起到一定作用.突变的DNA-PKcs具有正常的激酶活性，但不能活化Artemis.van Der Burg对没有出现发育迟缓或RAG1/2突变的B-T-NK+重症联合免疫缺陷患者进行基因分析发现了PRKDC的纯合突变[31].Mathieu等研究发现PRKDC缺陷患者的DNA-PKcs蛋白水平减少、激酶活性检测不到且DSB修复受损，该患者具有小头畸形、发育迟缓与严重的神经功能缺陷，表明DNA-PKcs在神经系统的发育中具有重要作用，同时DNA-PKcs突变不能诱导自身免疫调节因子依赖的基因表达，会出现器官特异性的自免疫炎症疾病[32].

3 CSR重组中DDR相关蛋白缺陷及其引起的表型

3.1 AID缺陷与UNG缺陷

B细胞中AID对抗体多样性非常关键，它通过诱导产生DNA断裂来进行CSR、基因转换与体细胞超突变(somatic hypermutation，SHM)[33].编码AID的AICDA基因缺陷是引起常染色体隐性遗传高IgM综合征最常见的原因[34]，UNG缺陷也可以导致高IgM综合征.发生应激时AID的表达上调，并将两条DNA链上IgH基因转换区的脱氧胞嘧啶脱氨基转化为脱氧尿嘧啶而启动CSR，随后UNG将DNA上的脱氧尿嘧啶移除并启动DNA修复途径[35].AID缺陷与UNG缺陷表现出淋巴结增生.对22个AID缺陷的患者进行分析，其中6个患者有自身免疫病或炎症，包括糖尿病、关节炎、自身免疫性肝炎、溶血性贫血、免疫性血小板减少症、克罗恩病和慢性葡萄膜炎.

3.2 INO80缺陷

INO80是染色质重构复合物的组成成分，哺乳动物INO80是端粒复制必需的，能维持基因组的稳定性[36].INO80通过移除DNA损伤部位的H2A.Z促进突触前纤维形成，进而促进了同源重组修复[37].在B细胞中的Sα和Eμ区域可以检测到INO80与黏附亚单位SMC，表明INO80在CSR中具有一定作用.Kracker等在两名IgM水平正常、IgG和IgA水平降低的患者中发现了INO80的缺陷[8].有研究表明，INO80可促进子宫肌瘤和非小细胞性肺癌等肿瘤的发生，提示我们靶向INO80染色质重构复合物可能是潜在的肿瘤治疗策略[38].

3.3 错配修复缺陷

在遗传性非息肉病性结肠直肠癌与林奇综合征患者中发现了错配修复基因的突变.结构性错配修复缺陷(constitutional mismatch repair deficiency，CMMRD)综合征是一种恶性肿瘤易感疾病，该病源于四个错配修复基因PMS2、MSH6、MSH2或 MLH1的双等位基因突变[39].该病瘤谱很广，主要包括血液、大脑和肠道肿瘤.PMS2缺陷会导致DNA先导链的高突变性，进而导致早期脑肿瘤发作[40].MSH6缺陷可以适度减少IgG尤其是IgG2亚型的水平，但不能减少IgA的水平，这种缺陷导致了Ig-CSR部分缺陷与SHM异常.体细胞MSH2和MLH1突变引起的错配修复缺陷会导致林奇综合征样肿瘤[41].

3.4 RNF168缺陷

发生DSB时，E3连接酶RNF168通过使H2A泛素化调节DNA损伤修复[42].同时RNF168还介导53BP1的泛素化，这一修饰对53BP1在DSBs位点的募集和发挥其DNA损伤修复、检验点调节与基因组完整性的维持等功能至关重要[6].RNF168缺陷会导致放射敏感性、免疫缺陷、体态异常和学习困难(RIDDLE)综合征，它是一种与DSB修复缺陷有关的免疫缺陷病[43].RIDDLE患者体内IgG 与IgA水平减少，且其临床特点与A-T相同.RIDDLE患者细胞内53BP1与 BRCA1在DSBs上的重新定位受损，但MDCI与NBS1在DSBs上的重新定位并未受到影响.

4 DDR缺陷导致免疫缺陷的治疗措施

无论NK细胞是否存在，B-T-放射敏感性SCID表型的患者都会出现复发或严重感染，因此治疗时需要重建免疫系统.B-T-放射敏感性SCID包括DCLRE1C (Artemis)、LIG IV与XLF的缺陷.对放射敏感性SCID进行造血细胞移植的结果表明，最小剂量的烷化剂和电离辐射对于提高存活率和降低远期影响至关重要[44].清髓性预处理方案很容易导致LIG IV与XLF的缺陷患者死亡，需要采用降低强度预处理方案.另一方面，患者残余的NK活性会排斥供体造血细胞.Artemis缺陷不会导致造血干细胞缺陷，在移植前需要用药物来清除宿主造血细胞和打开骨髓龛.目前常用的一个预处理方案是氟达拉滨、低剂量环磷酰胺和血清疗法联合治疗以清除T细胞.我们期待能研发出一种可抑制残余NK细胞活性和产生骨髓龛的非基因毒性预处理方案.

5 展望

近年来对DDR相关蛋白缺陷引起的原发性免疫缺陷表型进行了比较广泛的研究，这可为相关疾病的临床诊断提供依据，为其临床治疗提供很好的思路.尽管如此，DDR相关蛋白缺陷所致原发性免疫缺陷疾病的确切致病机制仍不完全清楚.因此构建新的DDR缺陷相关原发性免疫缺陷疾病动物模型，尤其是非人灵长类动物模型，这将有利于更好地研究并阐明其发病机理，并在此基础上开展更具针对性的治疗.