回医烙灸对大鼠腰椎间盘退变模型软骨基质的影响

尤 娜 ，许建峰 ，白 帅 ，林瑞珠 ，马玉宝 ，牛子瞻 ，张彦明 ，王英絮

（1.宁夏医科大学中医学院，宁夏银川750004； 2.宁夏医科大学总医院，宁夏银川750004；3.宁夏医科大学回医药现代化教育部重点实验室，宁夏银川750004）

腰椎间盘退变（Intervertebral disc degeneration，IDD）是腰椎间盘突出、腰椎管狭窄、慢性下腰痛等疾病的主要原因之一［1］。随着社会人口老龄化进程的加快，IDD将成为前所未有的公共卫生问题，轻者引起慢性腰腿痛，重者引起神经功能障碍，甚至截瘫［2］。软骨基质降解在椎间盘的退变病理过程中起到重要作用。特色的回医烙灸疗法不仅治疗腰椎间盘突出症疗效确切，而且可以防止腰椎间盘的退变，但作用机制不明［3］。因此，本实验采用回医烙灸疗法干预大鼠腰椎间盘退变模型，观察腰椎间盘软骨基质及主要调节因子MMP-3、TIMP-1的表达，为回医烙灸疗法防治腰椎间盘退变提供理论和实验根据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 2月龄清洁级Sprague-Dawley（SD）大鼠 40只，雄性，体质量（250±20）g，宁夏医科大学动物中心提供，动物饲养在宁夏医科大学实验动物中心进行。动物合格证号：SCXK（宁）2014-0014。动物分笼单独适应性饲养3 d，第5天开始造模。将SD大鼠随机分为4组：正常对照组、假手术组、模型对照组和回医烙灸组，每组各10只。

1.1.2 药品及试剂 Ⅱ型胶原纤维、MMP-3、TIMP-1，SABC、DBA试剂盒（武汉博士德）。氨基甲酸乙酯和4%多聚甲醛固定液购于银川市伟博鑫生物科技有限公司。灸法所用艾绒购于宁夏医药公司［豫郑食药监械（准）字2012第1270003号］。

1.2 实验方法

1.2.1 动物造模 适应性饲养3 d后，大鼠称重，术前X线片定位，模型对照组和回医烙灸组20只SD大鼠进行造模，以20%的氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉，麻醉满意后大鼠腹部剃毛，取仰卧位，四肢橡皮筋固定，常规碘伏消毒，铺无菌洞巾。采用旁正中切口，长大概1.5～2.0 cm，远端超过髂嵴2～3 mm，钝性分离腹直肌。用生理盐水湿纱布向头侧、对侧推移将肠管及腹膜，慢慢暴露腹后壁，保护好下腔静脉、动脉和输尿管，从脊柱附着点慢慢分离腰大肌，逐步暴露 L3/4、L4/5、L5/6、L6～S1腰间盘，采用21G微量无菌穿刺针对暴露的椎间盘行穿刺，针刺角度与椎间盘矢状面呈60°，平行于软骨终板进针，穿刺深度为2.3 mm，穿刺针贯穿整个纤维环全层，但不要损伤终板软骨。穿刺成功后，取出纱布，小心整理腹腔脏器，生理盐水冲洗腹腔，缝合腹膜层和肌层、关闭皮肤，无菌纱布覆盖。假手术组SD大鼠腹部皮肤剃毛，常规消毒铺巾，仅切开腹部皮肤后即缝合。术后大鼠单笼饲养，术后连续3 d每只大鼠臀部肌肉注射青霉素5万IU抗感染治疗。术后观察步态，进食，有无大便和尿潴留，伤口渗出和感染情况。4 w后即可获得稳定的 IDD 模型［4］。

1.2.2 治疗方法 造模4 w后开始干预，回医烙灸组固定好大鼠，将动物的铁器灸具轻轻置于大鼠命门到腰俞的皮肤之上，点燃灸槽内的3 g艾绒，发热的动物铁器灸具可使局部皮肤发红、轻微发泡，每周2次，每次约20 min，干预8 w后进行取材。空白对照组、假手术组和模型对照组：3组动物不予干预，正常饮食，8 w后取材。

1.2.3 软骨取材 8 w后以空气静脉栓塞处死动物，完整取出 L3/4、L4/5、L5/6、L6～S1椎间盘（包括终板、髓核和纤维环），L4/5椎间盘标本立即冲洗后置于4%甲醛溶液中固定24 h；后置于EDTA液37℃恒温箱中脱钙2个月，流水持续冲洗1 h，梯度乙醇依次脱水，进行二甲苯透明，浸蜡后石蜡包埋。

1.3 椎间盘蛋白多糖含量检测

取L3/4椎间盘组织，采用分光光度法，根据吸光度值折算成浓度测定蛋白多糖含量。

1.4 免疫组化观测Ⅱ型胶原纤维、MMP-3、TIMP-1蛋白的表达

采用免疫组化方法进行检测，方法步骤按照各试剂盒说明进行。图像分析处理：在400倍显微镜下随机选取8个不重叠的视野，测定阳性细胞，取每张切片均值作为其测量值。

1.5 统计学方法

所得数据采用SPSS 18.0统计软件包进行分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，4组的软骨细胞Ⅱ型胶原纤维、MMP-3、TIMP-1蛋白组间比较，采用One-Way ANOVA分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 椎间盘蛋白多糖含量

模型对照组腰椎间盘蛋白多糖含量明显低于正常对照组和假手术组（P＜0.05）。回医烙灸组蛋白多糖含量高于模型对照组（P＜0.05）。回医烙灸组蛋白多糖含量与假手术组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表 1。

表1 4组大鼠椎间盘蛋白多糖含量比较 （±s）

表1 4组大鼠椎间盘蛋白多糖含量比较 （±s）

注：与模型对照组比较，P＜0.05

组别 蛋白多糖（pg/mg)正常对照组 2.74±0.031）假手术组 2.61±0.011）模型对照组 1.03±0.02回医烙灸组 2.23±0.031）F 2.99 P＜0.05 1）

2.2 免疫组化观察II型胶原纤维、MMP-3、TIMP-1的表达

切片用DBA染色的阳性结果为软骨细胞胞浆呈棕褐色或棕黄色颗粒，阴性胞浆不着色或仅有背景着色。相对于模型对照组，回医烙灸组和正常对照组、假手术组椎间盘组织II型胶原纤维的含量较高（P＜0.05）；回医烙灸组椎间盘组织II型胶原纤维低于假手术组（P＜0.05）。回医烙灸组、假手术组和正常对照组椎间盘组织MMP-3阳性细胞数低于模型对照组（P＜0.05）；回医烙灸组椎间盘组织MMP-3阳性细胞数、假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型对照组TIMP-1阳性细胞数低于回医烙灸组、正常对照组、假手术组（P＜0.05）。回医烙灸组TIMP-1阳性细胞数和假手术组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表2。

表2 4组大鼠椎间盘II型胶原纤维、MMP-3、TIMP-1表达的比较（±s）

表2 4组大鼠椎间盘II型胶原纤维、MMP-3、TIMP-1表达的比较（±s）

注：与模型对照组比较，1）P＜0.05；与假手术组比较，2）P＜0.05

组别 Ⅱ型胶原纤维 MMP-3 TIMP-1正常对照组 181.92±10.581） 28.75±3.311） 47.63±11.211）假手术组 183.56±13.971） 32.54±2.731） 45.69±4.741）模型对照组 78.37±9.24 136.82±6.86 32.12±4.37回医烙灸组 152.48±7.451）2） 52.62±8.131）2） 42.34±1.051）F 3.58 4.02 3.61 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 讨 论

回医烙灸疗法是回族医药最具民族和地区特色的疗法之一，目前仍然是国内外非常盛行的一种治疗手段。烙灸疗法是用烙药或铁器烧灼直接烙烫于病痛体表部位，使局部发红发泡，促使机体康复的一种治疗方法。回医烙灸疗法是中医学化脓灸疗法的深化，加热后治疗面积大，并且灸量可控，具有铁制灸具传热均匀和迅速等优点。我们遵循《素问·上古天真论》“肾气平均，筋骨强劲”，《素问·脉要精微论》“腰者，肾之府，转摇不能，肾将惫矣”及《回回药方·针灸门》“是凡一体内，多有恶润凝聚以致本体，并其禀性作坏……必以火灸之，则本体病根尽去”之旨，采用具有浓郁民族特色的回医烙灸疗法治疗腰椎间盘突出症和防治腰椎间盘退变，有补肾通督、强筋健骨的临床功能，不仅能有效地改善腰椎间盘突出症的临床症状，而且还可以防治腰椎间盘退变［5］。在回医特色烙灸治疗腰椎间盘突出症和腰椎间盘退变良好疗效的基础上，进一步探讨其对腰椎间盘退变的疗效机制具有重要的意义。

细胞凋亡引起基质成分失衡、代谢紊乱，导致蛋白多糖和胶原纤维分解，其中蛋白多糖的减少与椎间盘的退变程度成正比，I型胶原增加和II型胶原减少，进而影响了纤维的强度，从而导致椎间盘弹性降低，抗压、吸收和分散负荷能力下降及退变的发生［5-7］。其中MMP-3属于基质分解酶类，在降解Ⅱ型胶原中起主要作用。TIMPs是MMPs活性的主要抑制剂，已发现的有TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 和 TlMP-4 等 4 型［7-9］。而当力学负荷和炎症刺激等周围环境发生改变时，可以诱导MMPs高表达，引起MMPs/TIMPs比例失衡，导致基质过度分解，腰椎间盘退变发生［10-14］。

通过本实验研究表明，回医烙灸组椎间盘组织中Ⅱ型胶原纤维和蛋白多糖的含量高于模型对照组（P＜0.05），说明回医烙灸疗法可以减少Ⅱ型胶原纤维和蛋白多糖的降解，从而延缓了腰椎间盘的退变。回医烙灸可能通过调节p38MAPK信号通路而减少软骨细胞的凋亡，进一步影响MMP-3和TIMP-1的表达，减少Ⅱ型胶原纤维和蛋白多糖的降解［12］。回医烙灸组椎间盘组织中MMP-3的表达低于模型对照组（P＜0.05），说明回医烙灸疗法可以使MMP-3蛋白表达减少。回医烙灸组椎间盘组织中TIMP-1的表达高于模型对照组（P＜0.05），说明回医烙灸疗法可以使TIMP-1蛋白表达增加。回医烙灸疗法可能通过调节MMP-3/TIMP-1的平衡，减少软骨基质的降解。形态学观察发现通过回医烙灸治疗，关节软骨表面稍粗糙，裂隙表浅，软骨细胞排列整齐，说明回医烙灸疗法具有良好的软骨修复功能［13-15］。

本研究发现特色的回医烙灸疗法可以改善椎间盘终板软骨细胞的基质环境，从而减少软骨细胞的凋亡，阐明回医烙灸疗法治疗腰椎间盘退变的部分作用机制，为回医烙灸防治椎间盘退变提供理论和实验根据，为深入挖掘这一具有浓郁地方特色的疗法奠定基础。