河北地区中国荷斯坦奶牛GHR基因F279Y位点多态性与泌乳性状遗传效应分析

王思伟，王学清，石少轻，李元迎，王 昆*

（1.河北省农林科学院粮油作物研究所，河北 石家庄 050000；2.河北一兽药业有限公司，河北 石家庄 050000）

奶牛的泌乳行为由神经内分泌系统分泌的多种激素和乳腺分泌的多种生长因子协同调控[1]，其中，以生长激素（growth hormone，GH） 为核心的生长激素轴对奶牛泌乳起重要的调控作用[2]。但是，GH作为生物大分子，无法直接穿透细胞膜，故需要与位于靶细胞膜上的生长激素受体（growth hormone receptor，GHR）结合，经由介导体传递信息至细胞内，才能发挥其功能。因此，GHR在奶牛机体组织中的含量和功能，以及GHR基因碱基序列的突变都可能影响GH的生理效应，从而影响奶牛的产奶性状[3]。

牛的GHR基因位于第20号染色体[4]，由10个外显子和9个内含子构成。Georges等[4]和Arranz等[5]在奶牛第20号染色体上检测到了影响奶牛泌乳性状的QTL。Blott等[6]首次发现，荷斯坦奶牛GHR基因的cDNA序列第836位存在T→A的单核苷酸突变，导致第279位氨基酸由苯丙氨酸变为酪氨酸（F279Y）。关联分析结果表明，该突变位点可导致奶牛产奶量显著增加，乳脂率和乳蛋白率显著下降。这一结论在芬兰艾尔奶牛群体中也得到了验证[7]。因此，奶牛GHR基因的F279Y突变位点被认为是影响奶牛泌乳性状的重要候选基因之一。

候选基因与数量性状的连锁关系通常出现在某一群体或特定群体的特定世代中，并与该群体的特定遗传背景相互作用。因此，为了将候选基因的遗传效应应用于畜禽经济性状的标记辅助选择中，就需要在不同品种或同一品种的不同群体中不断进行验证，甚至在同一群体中也要经过多个世代的验证[8]。河北是我国重要的奶牛养殖区域，2016年全省奶牛存栏约180.6万头，奶类总产量达448.0万t，居全国第3位。探讨河北地区荷斯坦奶牛GHR基因的遗传多态性及其与主要泌乳性状的遗传效应，以期为奶牛分子标记辅助选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为859头中国荷斯坦奶牛血样，分别采自河北省石家庄鹿泉、石家庄藁城、石家庄正定、唐山芦台和保定的5个牛场，产奶性状的表型记录由河北省畜牧良种工作站DHI中心提供。每头牛采集血液5 mL，即刻放入抗凝离心管中，上下摇动，编号并用冰盒保存，运回实验室后立即进行奶牛基因组DNA提取，置于-20℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取 采用血液基因组DNA提取试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）提取。

1.2.2 引物合成与PCR扩增 根据牛GHR基因核酸序列（NM 176608），利用primer premier 6.0引物设计程序设计引物，上游引物序列为5’-AATACTTGGGCTAGCAGTGACAATAT-3’，下游引物序列为 5’-ACTGGGTTGATGAAACACTTCACTC-3’。PCR产物的预期长度为175 bp。

PCR扩增反应体系为20 μL，其中，MasterMix 10.0 μL，上游引物 0.6 μL，下游引物 0.6 μL，基因组DNA模板1.0 μL，超纯水7.8 μL。PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；最后，72℃延伸7 min。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.2.3 RFLP分析 RFLP反应体系为10 μL，其中，PCR产物7.5 μL，限制性核酸内切酶SSpⅠ（10 U/μL）0.5 μL，Buffer 2.0 μL。反应条件为 37 ℃ 30 min。酶切产物上样于2.5%琼脂糖凝胶，恒压160 V，电泳50～60 min，在紫外灯下观察拍照，记录结果。

1.2.4 测序分析 经PCR-RFLP分析后，每个基因型随机回收纯化2个个体的PCR产物，送至北京六合华大基因科技有限公司进行正反方向直接测序。

1.3 数据统计与分析

1.3.1 基因型频率和等位基因频率 根据公式计算得到。

基因型频率=基因型个体数/测定群体总数

等位基因A的频率〔p（A）〕：

p（A）=D＋1/2H

等位基因 T的频率 〔q（T）〕：

q（T） =R＋1/2H

式中，D、H、R分别为AA、TA和TT基因型频率。

遗传杂合度（He）：

有效等位基因数（Ne）：

式中，pi为群体中第i个等位基因的频率，n为等位基因数。

多态信息含量（PIC）：

式中，pi和pj分别为群体中第i和第j个等位基因的频率，m为等位基因数。

皮尔逊卡方检验：

式中，O代表群体中每个基因型的观测数目，E代表假定Hardy-Weinberg平衡定律成立时每个基因型的期望个体数。

1.3.2 基因型与泌乳性能相关性分析 采用SAS（8.02）软件的MIXED过程进行产奶性状和基因型的关联分析。动物模型为：

式中，y为产奶性状表型记录，μ为群体平均值，F为场次效应，T为胎次效应，G为基因型效应，a为加性遗传效应，e为随机残差效应。

1.3.3 等位基因加性效应、显性效应和替代效应 根据公式计算得到。

等位基因加性效应：

等位基因显性效应：

等位基因替代效应：

式中，p为A等位基因频率，q为T等位基因频率，TT、AA和TA分别为各基因型的表型最小二乘均值。

等位基因替代效应的显著性检验利用线性回归模型（SAS），计算泌乳性状对T等位基因拷贝数（0、1、2） 的回归，分别将基因型TT、TA和AA定义为2、1和 0。

2 结果与分析

2.1 GHR基因F279Y位点的遗传多态性分析

以中国荷斯坦牛基因组DNA为模板，利用设计的引物扩增GHR基因F279Y位点，获得了1条长度175bp的片段。采用限制性内切酶SSpⅠ消化后，PCRRFLP的琼脂糖凝胶电泳结果（图1）显示3种基因型：175 bp，175、151、24 bp，151、24 bp，分别命名为TT、TA和AA。其中，长度24 bp的片段未显示。

图1 GHR基因F279Y位点的PCR-RFLP扩增结果Fig.1 PCR-RFLP amplification results of GHR gene F279Y locus

经统计，基因型TT、TA和AA的频率分别为0.394 6、0.544 8和0.060 5；等位基因T和A的频率分别为 0.667 1和 0.332 9。PIC为 0.33（0.25＜PIC＜0.50），属中度多态。He为0.444 2，Ne为1.799 2，Hardy-Weinberg平衡检测结果显示，该位点在河北荷斯坦奶牛群体中极显著偏离平衡状态。

2.2 GHR基因F279Y位点扩增片段的测序

图2 GHR基因F279Y位点不同基因型的测序结果Fig.2 Sequencing results of different genotypes of F279Y locus of GHR gene

将测序结果（图2） 与用GenBank中DGAT1基因的序列（GenBank登录号：NM 176608） 比对，发现其与TT基因型的核苷酸序列一致，AA基因型在第4 962 bp位点发生了T/A单碱基突变。

2.3 GHR基因F279Y位点与泌乳性状的遗传效应

GHR基因F279Y变异位点对中国荷斯坦奶牛5个泌乳性状的遗传分析结果（表1）显示，该突变位点对乳脂率的影响达到了显著水平，而对乳脂量、乳蛋白率、乳蛋白量和305 d产奶量的影响不显著。多重比较结果表明，TT基因型的乳脂率显著高于AA基因型，AA和TA、TT和TA基因型之间的差异不显著。TA基因型的乳脂量、乳蛋白量和305 d产奶量均高于其他2个纯合基因型，但未达到显著水平。等位基因替代效应显示，每个A等位基因替代T等位基因会导致乳脂率降低0.053%，乳脂量降低0.332 kg，乳蛋白率提高0.003%，乳蛋白量提高1.43 kg，305 d产奶量降低59.481 kg。T等位基因是乳脂率的优势等位基因。

表1 GHR基因F279Y位点基因型与泌乳性状的遗传效应分析Table 1 The genetic effects of F279Y locus genotypes of GHR gene on the milk production traits

3 结论与讨论

GHR基因是影响奶牛泌乳性状的重要候选基因之一，明确该基因的遗传多态性及其对奶牛泌乳性状的影响，进行分子标记辅助选择，对提高奶牛产奶性状，加快育种进程，实现优质品种改良具有深远意义。Banos等[9]对571头苏格兰荷斯坦奶牛该位点的多态性进行研究后发现，等位基因A的频率为0.20，T的频率为0.80，TT型为优势基因型，与Sirja等[7]对芬兰爱尔夏牛的研究结果一致。王丽娟等[10]对天津和济南的351头荷斯坦奶牛进行多态性分析，发现等位基因A和T的基因频率分别为0.633 9和0.366 1，优势等位基因为A，与马彦男等[1]对甘肃232头奶牛的检测结果一致。而马妍等[11]对北京地区1 145头荷斯坦奶牛进行分析后发现，等位基因A和T的基因频率分别为0.361和0.639，优势等位基因为T，与郭晓飞等[12]和杨雪瑶等[13]的研究结果一致。本研究对河北地区859头荷斯坦奶牛的多态性进行了检测，结果表明，等位基因A和T的频率分别为0.332 9和0.667 1，T为优势等位基因，与马妍等[11]、郭晓飞等[12]和杨雪瑶等[13]的研究结果一致。经计算，该位点处于中度多态，遗传改良潜力较好，等位基因分布较均匀，极度偏离H-W平衡，说明该位点在河北地区受到了非自然选择。综合分析表明，该位点在河北荷斯坦奶牛群体中处于被非自然选择因素破坏了平衡状态，是适合应用于遗传选育的候选位点。

研究证实，GHR基因突变位点F279Y对奶牛的泌乳性状有显著影响，但不同研究结果显示的影响指标略有不同。Banos等[9]研究表明，等位基因A能提高奶牛的产奶量。Sirja等[7]对芬兰爱尔夏牛的研究结果显示，等位基因A是产奶量的优势等位基因，T是乳脂率和乳蛋白率的优势等位基因。马彦男等[1]研究表明，AA基因型的305 d产奶量显著高于AT基因型，AT基因型的乳脂量、乳蛋白量和乳糖量虽然高于AA基因型，但未达到显著水平；杨雪瑶等[13]则认为，3种基因型之间的305 d产奶量差异不显著，TT基因型的乳蛋白率和乳脂率极显著高于其他2个基因型；王丽娟等[10]的研究结果显示，TT基因型的乳脂率显著高于AA型，其他指标未达到显著水平。本研究发现，该突变位点对奶牛的乳脂率有显著影响，等位基因T是乳脂率的优势等位基因，与王丽娟等[10]的研究结果一致；同时，TA基因型与纯合基因型相比具有更高的乳脂量、乳蛋白量和305 d产奶量，但未达到显著水平，与马彦男等[1]的研究结果相似。

综上所述，GHR基因F279Y突变位点对河北地区荷斯坦奶牛的乳脂率遗传效应较大，可将其应用于分子标记辅助选择。GHR基因的F279Y位点对奶牛的产奶性能具有重要的调控作用。但是，由于环境条件、品种以及选育背景等因素影响，GHR基因的F279Y位点的遗传多态性对不同地区不同群体奶牛泌乳性状的影响不尽相同。因此，要想将该基因实际应用于奶牛品种选育，还需明确该基因对研究群体的具体遗传效应，并结合其他候选基因进行综合分析。