皖贝母产生物碱内生真菌的筛选与鉴定＊

许 勇，戴陈伟，董朝阳，蔡 标

（安徽省医学科学研究院微生物研究所 合肥 230061）

贝母皖贝母为百合科（Liliaceae）贝母属（FritillariaL.）植物安徽贝母（Fritillaria anhuiensisS.C.Chen et S.P.Yin）的干燥鳞茎，1985年被认定为国家一类新药，自然分布于大别山区与江淮丘陵区，具有清热、化痰、止咳镇喘等功效[1-2]，可用于治疗急、慢性支气管炎等疾病[3]。研究发现，皖贝母的主要活性成分为异甾生物碱，如贝母素甲和贝母素乙等[4]。近年来，由于全球气温变暖，肺疾增多，贝母的需求量急增，导致野生资源采挖过度，以及农户种植倾向的变化，皖贝母药用资源已经比较匮乏[1,5]。

植物内生菌是指那些其全部或部分生活史在健康植物的各种组织或细胞内部度过的真菌或细菌（包括放线菌），其存在不引起明显的宿主感染症状，但可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离[6]。植物内部存在真菌的现象十分普遍[7]，具有促进植物生长、合成植物激素、增加植物抗胁迫能力、提高植物光合作用和抗病抗虫能力等作用[8]。内生真菌长期生活在植株体内的特殊环境中与其协同进化，能够产生与宿主植物相同或相似的次生代谢产物[9]，甚至新的化合物[10]。1993年，美国科学家Stierle首次从内生真菌中分离出了和宿主相同的具有抗癌作用的活性物质[11]。近年来，药用植物内生真菌产抗菌类活性物质、抗肿瘤和抗氧化活性类物质、免疫抑制活性物质和其他活性物质等方面的研究越来越多，成为内生真菌研究的热点领域[9]。从药用植物中分离筛选出了产活性物质的内生真菌，借内生真菌产生的新型化合物填充天然药用的资源库，成为缓解药用资源紧张的局面的一条途径。厉秀秀等从黄连（Coptis chinensisFranch.）中筛选出了产小檗碱的拟茎点霉属内生真菌（Phomopsis）[12]，侯晓强等从铁皮石斛（Dendrobium officinale）分离出了8株具有促生长活性的内生真菌[13]，毕江涛等从药用植物车前（Plantago asiaticaL.）内分离出11株内生真菌对1种或多种植物病原真菌指示菌有不同程度的抑制作用[14]。

目前，尚未见有关从皖贝母中分离出产活性成分的内生真菌报道，本试验对皖贝母内生真菌进行分离，并对这些内生真菌的代谢产物进行检测，旨在从皖贝母中筛选出能够产生物碱的内生真菌，为解决皖贝母药用资源匮乏的问题提供理论依据。

图1 内生真菌bm-2菌株产生物碱的TLC分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

贝母采自安徽省霍山县太平畈乡农户家中，由安徽中医药大学王德群教授鉴定为安徽贝母（Fritillaria anhuiensisS.C.Chen et S.P.Yin）。

1.1.2 仪器与试剂

JK-300超声波清洗器（金尼克）；SQ810C压力灭菌器（YAMATO）；U3000高效液相色谱仪（（Thermo Fisher）；3300旋转蒸发光检测器（Alltech）；MJX-160B-Z霉菌培养箱（博讯）；Veriti梯度PCR仪（ABI）；SW-CJ-ID 超 净 工 作 台（AIRTECH）；ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱（Waters）。贝母素甲和贝母素乙标准品购于成都普菲德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 内生真菌的分离与纯化

取安徽贝母鳞茎部位，在无菌条件下将表面清洗干净，晾干后用75%酒精浸泡1.5 min，无菌水冲洗1次，84消毒液浸泡5 min，无菌水冲洗1次，再用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗干净。将鳞茎切割成0.5*0.5 cm2的块状，截面向下置于含青霉素的马铃薯葡萄糖培养基（Potato Dextrose Agar，PDA），最后一次冲洗液作为对照。28℃条件下培养，观察期间菌落形态、颜色等特征，将形态、颜色不同的菌落转接到新的固态培养基上，编号，28℃培养3-7天，放入4℃冰箱保存[3,15]。

1.2.2 内生真菌发酵液及标准溶液的制备

将菌种于PDA培养基活化4天后，取直径为6 mm的菌块接种到PDA液体培养基中（100 mL 250 mL-1），置于26℃恒温摇床中130 r min-1培养7天。收集发酵液，60℃减压浓缩至5 mL，加浓氨水调至pH 9-11，20 mL二氯甲烷萃取2-3次，收集油层，挥干，用0.5 mL甲醇定容，制得样品制备液[15]。

取贝母素甲对照品和贝母素乙对照品，加三氯甲烷分别制成每1 ml各含0.2 mg和0.15 mg的混合溶液，作为对照品溶液。

1.2.3 薄层层析（Thin Layer Chromatography，TLC）检测

吸取样品制备液 10～20 μl、对照品溶液 10 μl，分别点于薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（17∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。

1.2.4 高效液相色谱-旋转蒸发光检测器分析（High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light Scattering Detector，HPLC-ELSD）

色谱条件：色谱柱C18，100 ×2.1 mm，1.7 μm；流动相：乙腈-水-二乙胺（70∶30∶0.03）；流速：0.2 mL·min-1。ELSD参数设置为雾化温度65℃，蒸发管温度70℃，气体流速1.6 L⋅min-1。分别精密吸取对照品溶液10 μl、20 μl，供试品溶液5-15 μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算贝母素甲、贝母素乙的含量。

1.2.5 形态学鉴定

将菌株接种于PDA培养基上，置于霉菌培养箱中，25℃培养15天，观察菌落生长情况，记录菌落的菌群特征，并于显微镜下观察菌丝、分生孢子、分生孢子梗、产孢结构的形态特征，参照《真菌鉴定手册》中的描述，对真菌进行鉴定[15,16]。

1.2.6 分子生物学鉴定

以真菌通用引物ITS4，扩增真菌的ITS序列测序委托测序公司完成。根据真菌的ITS序列，用MEGA 7构建分子进化树，采用Neighbor-Joining法的Complete Deletion模式建树，用Bootstrap进行检验，并重复1000次[17]。

2 结果与分析

2.1 产生物碱内生真菌的筛选

从皖贝母的鳞茎中共分离得到6株内生真菌。如图1所示，利用TLC法对该6株内生真菌样品制备液进行鉴定发现，菌株bm-2样品制备液中出现一个斑点与贝母素甲的迁移率一致，Rf值为0.676。另有一处斑点与在贝母素乙标准品斑点附近，但不完全一致，Rf值为0.781。

2.2 内生真菌bm-2产贝母生物碱分析

对bm-2菌株样品制备液进行HPLC-ELSD分析，最高峰出峰时间为3.803 min（图2-A），贝母素甲标准溶液出峰时间为3.844 min（图2-B），二者出峰时间非常接近，表明内生真菌bm-2能够产生与贝母素甲相同或者相似的化合物。在贝母素乙的出峰时间4.296 min附近（图2-C），bm-2菌株粗提液并未出现峰值（图2-A），这表明其中未发现与贝母素乙相同或相似的化合物。根据图2-A峰面积，计算出bm-2菌株发酵液贝母素甲的产量为0.7353 mg⋅L-1。

2.3 形态学鉴定结果

bm-2菌株在平板上菌落形态：初期生长呈绒毛状，白色或灰黑色。后期生长疏松，呈棉絮状。显微镜观察：分生孢子梗直接从菌丝上长出，与菌丝无明显差异，在顶端形成分生孢子。分生孢子呈卵形，成串排列（图3）。根据菌落形态和显微特征，参照《真菌鉴定手册》的特征描述，初步推断其为极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）。

2.4 分子生物学鉴定结果

如图4所示，内生真菌bm-2的ITS序列长度约在750 bp，其扩增条带清晰。经ITS序列比对，发现bm-2的ITS序列与极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）的同源度达到100%。由bm-2的ITS序列与其他相似度高且具代表性的序列，以亲缘关系较近的忍冬黑痣菌（Rhytisma lonicerae）为外类群构建系统进化树（图5），结合形态学鉴定结果，将bm-2确认为极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）。

图2 bm-2样品制备液的HPLC分析

3 讨论

为缓解贝母药用资源的匮乏，研究者们尝试从贝母中筛选鉴定具备药用活性的内生真菌。陈鹊等从甘肃贝母中分离出了一株具有抑菌活性的镰刀菌属接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinum）[15]，陈娟丽等从平贝母中筛选出了可产西贝母碱的头孢霉属真菌（Cephalosporium）[18]，潘峰等从瓦布贝母中分离出了一株能够产贝母辛和贝母素乙的镰刀属真菌（Fusarium）[19]，但尚未发现从皖贝母中筛选分离活性内生真菌的报道。

图3 bm-2的显微镜鉴定

图4 菌株bm-2的ITS-PCR扩增电泳图

图5 菌株bm-2的rDNA-ITS生物分类系统进化树

本研究通过TLC法从皖贝母的鳞茎中筛选出1株真菌bm-2，其发酵液中含贝母素甲成分。rDNA-ITS序列分析与传统形态学鉴定相结合是目前鉴定真菌的主要手段[7，9]。rDNA-ITS序列分析结果显示菌株bm-2与极细链格孢菌的同源度达到100%，同时菌株bm-2的形态学特征也与极细链格孢菌相吻合。综合形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，将菌株bm-2鉴定为极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）。链格孢属细菌是药用被子植物内生真菌的优势菌群[10]，彭三妹等也曾在浙贝母的鳞茎中分离出了交链孢霉属（Alternaria）真菌[20]。杨宇等曾对皖贝母的内生真菌进行过初步探索，从皖贝母中分离出了被孢霉属（Mortierella）和青霉属真菌（Penicillium）[3]，与本研究并不相同，这可能是由于肉质组织中的内生真菌的密度和种类随着植物生长发育环境的不同也有着很大的不同，在很大程度上表现出环境依赖性[7]。

和甘肃贝母、平贝母和瓦布贝母[17]中筛选分离出的产生物碱的内生真菌相同，本研究中筛选获得的极细链格孢发酵液中仅含产量很低的贝母素甲（0.7353 mg·L-1），不含贝母素乙，这种产量水平无法直接进行工业化生产。高杨等以产小檗碱的内生真菌S6为出发菌株，采用多种单一或复合诱变措施对其菌丝体进行诱变处理，最终筛选得到高产菌株s-nu-302，其小檗碱产量比出发菌株提高170%，达到12.28 mg⋅L-1[21]。殷红等对s-nu-302的发酵条件进行优化，使该菌株的小檗碱得率提高了47.2%，菌体生物量提高了24%[22]。殷红等还对平贝母鳞茎中内生真菌菌株fu7的发酵条件进行优化，将菌丝干重和西贝素含量分别比在基本培养基中提高了约155%和77%[23]。除了人工诱变和优化发酵条件以外，通过基因工程手段改造菌株也是提高活性物质产量的可行途径。

同时，内生真菌离开植物体后，通过反复的继代培养，合成次生代谢产物的能力会下降，这种退化现象普遍存在，也是限制其活性物质产量稳定的重要因素[8,24]。kusari等、li等都报道了内生真菌的退化现象，这可能是由于在没有宿州植物特定刺激的情况下，产物基因无法正常表达[25,26]。崔欣等在1株具有产西贝碱能力的平贝母内生真菌的培养基中加入3%平贝母药材，发现其发酵液中西贝碱产量可达到0.0563 mg⋅L-1，比出发菌株提高了21.9%，且具有良好的遗传稳定性[27]。然而kusari等通过将内生真菌接种回宿主植物的方法，虽然恢复了菌株形态，但次生代谢产物量并未恢复[28]。因此，不同的内生真菌或宿主植物其退化机理也不尽相同，探索有效的复壮手段前提是了解真菌合成宿主植物次生代谢产物的分子机制[8]。

由于植物源和微生物源的酶类的联合作用，微生物的基因表达在植物体内受植物生理环境的影响等原因，内生真菌不仅能够促进宿主植物合成活性成分，还可自身合成新的药物活性物质[7,9]。这些化合物一般对病原物有抑制作用，在植物对病原物的能动抗性中起到十分重要的作用[7]。kharwar等发现印度楝的一株内生真菌可以产生能够显著抑制人类及植物病原菌的活性物质——爪哇镰菌素[29]。新化合物的合成往往需要微生物与宿主植物相互作用才能完成，微生物单独或者植物单独通常都不能合成[7]。因此，检测鉴定皖贝母内生真菌所产生的新型化合物及其药理活性，也是进一步深入研究的方向。如今，根据内生真菌能产生与宿主相同或相似次生代谢产物的理论，人们还能将一些珍贵药用植物的内生真菌进行扩大培养，提取生物活性次生代谢物，生产新型的大众化保健饮料[9]。