包头市牛隐孢子虫感染情况调查研究

李玉娟

（包头轻工职业技术学院，内蒙古 包头 014035)

本研究基于隐孢子虫的18S rRNA的PCR技术调查犊牛隐孢子虫的感染情况，并利用多位点分型技术对分离获得的分离株进行基因分型，进一步评估人兽共患风险。

1 材料

1.1 样品

2017年3月在包头郊区的4个牛场共采集50份犊牛粪便进行隐孢子虫感染，样品保存于重铬酸钾溶液（2.5%）。

1.2 试剂

2íTaq Master Mix（北京康为世纪生物科技有限公司）；粪便基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）；DL 2000 DNA Marker（宝生物工程有限公司产品）。

1.3 引物

参照Xiao等设计的套式PCR引物，扩增隐孢子虫的18S基因。参照Feng等应用MLST对本试验中所获得的分离株的小卫星基因位点MS1、MS2、MS3和MS16进行扩增。引物由上海生工合成。

2 方法

2.1 提取样品DNA

参照粪便基因组DNA提取试剂盒说明书，提取50份犊牛粪便样品基因组DNA。

2.2 PCR反应

反应体系为：12.5 μL 2íTaq Master Mix，上下游引物各 1 μL，2 μL 模板 DNA， 双蒸水补齐至 25 μL。 扩增条件：94℃预变性 5 min；94℃变性 45 s，退火 45 s，72℃延伸 1 min， 共 35循环；72℃延伸 10 min。PCR阳性产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.3 测序及进化树分析

将第二轮PCR阳性产物送至金唯智生物科技（北京）有限公司进行测序。为了确定隐孢子虫的种，基于18S基因，利用MEGA 4.0软件构建进化树，复制数为1000。将MS1、MS2、MS3和MS16的测序结果直接在NCBI中BLAST检索，确定其基因型。

3 结果与分析

3.1 PCR扩增结果

50份提取的DNA样品中，只有8份样品成功扩增出约850 bp的目的条带，且无非特异性扩增，

3.2 隐孢子虫的进化树分析

8份样品有效长度均为830 bp。为了进一步确定隐孢子虫的种，以NJ法构建分子进化树，其中5个隐孢子虫分离株（S1、S2、S3、S4、S5）与安氏隐孢子虫（登录号：KF271478）位于一枝，而另外3个分离株（S6，S7，S8）与牛隐孢子虫（AY741305）聚为一枝，并且具有较高的节点值（100和 88），这一结果表明S1、S2、S3、S4、S5 为安氏隐孢子虫，S6，S7，S8 为牛隐孢子虫。

4 讨论

根据文献报道牛可感染7种隐孢子虫，它们分别是微小隐孢子虫，牛隐孢子虫，安氏隐孢子虫，瑞氏隐孢子虫，人隐孢子虫，猫隐孢子虫和猪隐孢子虫。本研究隐孢子虫的感染率为16%，且只检测到牛隐孢子虫和安氏隐孢子虫，其中安氏隐孢子虫为优势种，西北地区气候较干燥，不利于隐孢子虫的生存和传播，且本试验所研究的犊牛是圈舍内饲养，与外界环境接触较少，这些因素对该地区隐孢子虫的发育和传播可能产生一定的影响。本研究中没有检测到人兽共患的隐孢子虫-微小隐孢子虫，这可能与采样的数量或地点有关，为了进一步调查包头市牛感染隐孢子虫的情况和评估人兽共患风险，须在不同的区域采集更多的样品。