高效液相色谱-串联质谱测定熟肉制品中氯霉素药物残留

◎ 肖植国，梅 群，孔维芬，张 馨

（曲靖市食品药品检验检测中心，云南 曲靖 655000）

氯霉素类药物具有广谱抗菌能力，在水产养殖和畜牧养殖中都广泛应用。这些药物基本性质一般都比较稳定，而且不容易降解，尤其在水产品中的残留物可以通过食物链循环进入人体，激素类，主要有氯霉素和甲砜霉素还有氟苯尼考等组成。氯霉素具有很强毒副作用，可抑制人体骨髓造血功能，不断影响人类的再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等[1-3]。是白色或无色的针状或片状结晶，熔点149.7～150.79 ℃，易溶于甲醇、乙醇、丙醇及乙酸乙酯，微溶于乙醚及氯仿，不溶于石油醚及苯。氯霉素极稳定，其水溶液经5 h煮沸也不失效。

氯霉素分子中含有对位硝基苯基基团、丙二醇和二氯乙酰胺基。由于氯霉素分子中有2个不对称碳原子，所以氯霉素有4个光学异构体，其中只有左旋异构体具有抗菌能力。氯霉素类药物残留检测方法主要有微生物法、酶联免疫法、气相色谱法、液相色谱法、超高效液相色谱法、液相色谱-质谱法和超高效液相色谱-串联质谱法等[4-6]。

其中超高效液相色谱-超高效液相色谱借助于HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量，具有分析速度快、选择性强 、灵敏度高等优点，是氯霉素类药物分析首选的方法。处理一般采用乙酸乙酯或乙腈反复多次提取、正己烷萃取、浓缩溶解，过固相萃取柱（SPE）净化，再氮吹浓缩，定容测定。

原料熟肉出现问题，需要快速准确可靠的检测方法进行佐证。对熟肉制品中氯霉素和中氯霉素类药物残留的检测具有很重要的意义。较好的样品前处理方法具有有机试剂消耗量少、测定周期短、选择性好、灵敏度高和定性定量准确等特点。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

岛津30A超高效液相色谱仪（日本岛津），岛津8040质谱仪（日本岛津），Mettler TLEDO205DU电子天平，PURELAB F1一体式超纯水仪（英国ELGA公司），TGL-10B型离心机（上海安亭科学仪器厂），10～1000 μL移液器（Transferpette德国），ZH-2DLENDER型涡旋振荡器（杭州高德泰林）。

1.2 仪器条件

1.2.1 色谱条件

选择SHIMADZUShimpack FCODS柱（85 mm×4.6 mm，3 μm）为分析柱，甲醇（A）和0.1%甲酸（B）作流动相，流速0.2 mL/min，柱温40.0 ℃。采用梯度洗 脱：0～ 2 min，20% ～ 95% A；2.0～ 2.01 min，95%～20%A；2.01～11.0 min，20% A。色谱柱：岛津Shim-Pack FC-ODS75 mm×4.6 mm；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；流动相：甲醇+水，洗脱液。

1.2.2 质谱条件

采用多反应监测（MRM）模式，使用TIS（+）源分析。多反应监测（MRM），离子源温度（TEM）550 ℃；辅助气流速（GS2）：70 psi；发现样品测试结果和加标回收率无差别，标准溶液溶剂的选取分别比较了甲醇、超纯水、0.1%甲酸。使用甲醇作溶剂时，定量离子对、碰撞气能量（CE）及碰撞室出口电压（CXP）、碰撞室入口电压（EP）和去簇电压（DP）。使用超纯水和甲酸水溶液作溶剂时3种峰的峰型对称且尖锐，同时考虑到与实际水样分析时的一致性，故选择超纯水作溶剂。同内径（0.22 μm）的水相滤头进行实际水样、滤头不同品牌材质（PES）、加标水样的比较，3种化合物的峰型毛刺很多，甚至出现双头峰。

1.3 样品前处理

1.3.1 液体熟肉

用1000 mL棕色玻璃瓶采集满瓶水样，不留顶空，采集后储存在4 ℃暗处，当天分析。地表水及饮用水源地等干净水样可直接进样，废水或较脏的水样可过0.22 μm水相滤头后再进样。准确称取5 g试样于50 mL离心管中，加入50μL氘代氯霉素内标100 μg/L的工作溶液，加入10 mL乙腈和1 g氯化钠，以8000 r/min离心10 min，上清液转移至另一个20 mL试管中，合并乙腈提取液于50 ℃水浴氮气吹至约3 mL，加入乙腈饱和正己烷约3 mL涡旋混合萃取3次，气吹至近干，20%（v∶v）甲醇水定容至1.0 mL，过0.22 μm水相滤膜后上机测定。

1.3.2 熟肉粉

试样于50 mL离心管中，准确称取2 g，在加入50 μL氯霉素-D5，准确称取100 μg/L溶液，加入15 mL水振荡至奶粉完全溶解，以后步骤与之前的相同。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的优化

在肉制品加工中，常加入一定量的天然物质或化学物质，这对肉制品加工的质量提高有一定的作用，而且正确使用辅料，也对提高肉制品的质量和产量有着很重要的作用，尤其要增加肉制品的花色品种，提高商品价值和营养价值，都具有十分重要的意义。熟肉粉的前处理，先采用16 mL纯净水充分溶解奶粉中沉淀物质，超声15 min，再加入乙腈提取，这种分解式的提取方法效果更好。节约了成本，节约处理时间。这种方法与国家标准相比较，样品前处理基质干扰较小，缩短了分析周期，节省了大量浓缩和固相萃取净化的时间[7]。

2.2 不同条件下色谱条件的选择

国家标准：采用甲醇水（60∶60=V∶V）∶乙腈水（60∶60=V∶V）比例同等梯度洗脱。或者选择SHIMADZU Shimpack FCODS柱（75 mm×4.6 mm，5 μm），甲醇（A）和0.3%甲酸（B）作流动相，流速0.2 mL/min，柱温40.0 ℃。采用梯度洗脱：0～5 min，30% ～ 95%A；4.0～ 2.01 min，95% ～ 20%A；4.01～11.0 min，20%A。在不同的环境下实际测量定样品时，分流进样，降低样品进入色谱柱的量。原料的浓度不同时，一般可以用分流。微量组分一般不用分流，分流比太小或进样量太大，目标物与干扰不同杂质的液体流出，在不同的环境下会对目标物的离子化产生严重的抑制作用。采用甲醇溶液梯度洗脱，目标物得到很好的分离，不同色谱条件选择的同时检测中杂质对目标物质离子化具有抑制作用。

3 结语

样品净化的之前的步骤处理优化很关键，乙腈使用量减少，避免了净化柱的污染。这不但意味着此次试验具有简单、快速、灵敏度高、准确性强等特点。同时也降低了时间成本，还可以减少了实验过程中有机试剂对身体的危害。这种方法同时也可以适用于熟肉制品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素含量的测定。