miRNA诱导细胞自噬参与帕金森病研究进展

刘卫花，赵光峰

(海南省中医院，海南 海口 570100)

帕金森病(PD)的病理基础为黑质中的多巴胺能神经元(DN)发生病变，导致多巴胺(DA)的生成发生障碍，从而造成神经元内多巴胺能与胆碱能两系统间平衡失调，进而表现出静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常等临床表现[1-2]。其中，miRNA 作为一类非编码小RNA分子，参与调控细胞凋亡、自噬，在介导PD的发生及发展中占据重要地位[3-4]。

1 自噬与PD

1.1自噬的生物学特点 自噬是指细胞在受到内外环境的不利因素(如营养缺乏、低氧等)刺激时的一种自我保护的过程。该过程将细胞内变性的蛋白质和受损、衰老的细胞器，甚至病原微生物通过溶酶体降解，以实现物质的再循环和维持细胞代谢平衡及内环境稳态。自噬分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬(CMA)等[5]。自噬是细胞生存的一种方式，同时也是死亡使者，对细胞死亡的调节具有双重性。温和的自噬一定程度上保护细胞免受有害条件的侵害而促进细胞存活；当胞内待降解物质的积累速率超过自噬的清除能力，就会引起自噬严重或快速过度的激活，直接导致细胞程序性死亡，被称为自噬性细胞死亡(ACD)[6]。

1.2自噬参与PD PD主要病理改变是中脑黑质区致密部多巴胺能神经元的缺失和路易小体的沉积，具体机制被认为与氧化应激，线粒体功能障碍和蛋白质清除功能障碍，α-突触核蛋白的错误折叠、聚集和异常降解等相关[7]。线粒体功能障碍可以表现为线粒体外膜渗透，导致神经元凋亡；蛋白质清除功能障碍是因为细胞自噬功能紊乱，亦会引起神经元自噬性死亡；α-突触核蛋白的突变会破坏α-螺旋结构，使其结构以形成β-折叠，进一步聚集，产生神经毒性寡聚体的动作，引起细胞内的α-突触核蛋白聚集，抑制自噬，引起恶性循环，导致神经退行性改变。同时，突变型的α-突触核蛋白可以与溶酶体膜上的受体结合，并影响其降解和其他物质相结合[8]。Hu等[9]从在体和离体角度，分别应用MPP+和MPTP诱导的细胞和动物PD模型用于研究地骨皮甲素对PD的影响。离体研究结果表明地骨皮甲素可以改善细胞损伤和线粒体膜电位(MMP)的损伤，并抑制MPP+诱导的神经元细胞Bax/Bcl-2比例和调控MAPKs家族。此外，动物实验表明，地骨皮甲素可改善运动功能和神经元活性，并增加黑质(SN)和纹状体(Str)中酪氨酸羟化酶(TH)的阳性细胞；降低脑中α-突触核蛋白的表达。地骨皮甲素在体外和体内都发挥了明显的自噬增强作用。总体来说，由于凋亡抑制和自噬增强而保护免受神经毒素诱导的PD，这表明自噬在PD发病中的重要性不容忽视。

自噬溶酶体途径(ALP)是初级溶酶体与来自自噬作用的含有内源性物质的囊泡即自噬体融合或溶酶体吞噬细胞质而形成，在细胞内起“清道夫”作用，是破坏细胞器和清除细胞内受损蛋白质的重要手段。 ALP损伤被认为与PD的发病机制相关，晚近研究发现一些衍生自天然植物的活性化合物可能通过调节ALP并在PD的实验模型中发挥神经保护作用，初步证实，提高神经元自噬效用可能是PD治疗中的有效策略[10]。Xu等[11]报道了一种来源于萸肉果实的化合物loganin在PD的小鼠模型中介导神经保护作用的效用。通过以30 mg/(kg·d)的剂量给予1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)5 d，建立亚急性PD模型并用loganin处理。结果显示，Loganin能降低纹状体中多巴胺水平和酪氨酸羟化酶(TH)表达，缩短小鼠的总运动活性(TLA)时间。此外，loganin缓解小胶质细胞和星形胶质细胞的活化，并通过c-Abl-p38-NFκB途径抑制TNF-α和caspase-3的表达，下调LC3-II和Drp1表达，降低酸性囊泡细胞器(AVOs)的水平。证实Loganin通过减少炎症、自噬和细胞凋亡对MPTP诱导的PD小鼠发挥神经保护作用，鉴于神经元自噬和凋亡在PD发病中的重要性，有效调控神经元自噬、凋亡对于PD防治是有效的。

研究发现，微管依赖性转运、线粒体功能障碍和自噬性病理学的变化参与了散发性PD的神经变性。然而，连接这些事件的机制链接仍然不明。在散发性PD患者来源的细胞中，NAD+代谢发生改变，导致Sirtuin-2的活化和随后的乙酰化-α-微管蛋白水平的降低。Sirtuin-2脱乙酰酶活性的抑制选择性地增强α-微管蛋白乙酰化，促进了错误折叠的蛋白质的运输和清除。而且，Sirtuin-2敲除小鼠神经元在暴露于1-甲基-4-苯基吡啶鎓离子(MPP+)后微管组装没有改变，允许维持正常的自噬通量。说明sirtuin-2可能通过乙酰化控制自噬系统功能，证实自噬介导散发性PD中线粒体代谢与神经变性之间的关系[12]。

显然，自噬参与PD的多个环节,调节PD中神经元凋亡和神经元自噬的途径将会是一个非常有效的神经保护措施。

2 miRNA与PD

2.1miRNA的生物学特点 miRNA是有21～23个核苷酸(nt)的非编码单链微小RNA，能够通过序列特异性的方式来调节靶基因表达。miR是由一段具有发夹环结构，长度为70～80 nt 的单链RNA前体(pre-miRNA)经Dicer酶加工后生成的。成熟miRNA与RNA诱导的基因沉默复合物(RISC)结合形成非对称RISC复合物。RISC复合物中的单链miRNA与靶mRNA上任意与之互补的序列配对，从而抑制基因转录或使mRNA降解而抑制基因表达[13]。miRNA 是动植物生长发育过程中重要的调节因子，参与胚胎发育、细胞分化、器官发生、物质代谢等广泛的生命过程。对尸检证实的PD和正常对照病例的SNCA 3'非翻译区进行了深度测序分析，然后对鉴定潜在的微小RNA(miRNA)结合位点，进行遗传关联分析。研究确定4个miRNA结合位点，并观察到不同同基因诱导的多能干细胞衍生的多巴胺能和胆碱能神经元中每个miRNA的神经元型特异性表达谱。通过miRNA调节SNCA表达是神经元型特异性的，可能在α-突触核蛋白表型异质性中起作用，参与PD的发病[14]。

2.2miRNA在PD中的作用 晚近报道，miR-137、miR-124和miR-184在中枢神经系统中广泛表达，对神经元调节至关重要[15]。研究表明，microRNA与PD密切相关，miR-7、miR-153、miR-34b和miR-34 c在PD中表达均显著下降，并直接调控α-突触核蛋白突变[16]。国内学者观察miR-137对Parkin诱导的线粒体自噬影响，将miR-137 mimics和miR-137 inhibitor分别转染进HeLa细胞8 h后，再转染pEGEPC1-Parkin，24 h之后加羰基-氰-对-三氟甲氧基本腙(FCCP)处理4 h或者不加FCCP，利用免疫荧光和蛋白免疫印迹技术分析miR-137对线粒体自噬的影响[17]。用实时定量PCR方法检测PD患者与健康对照者血液样本中miRNAs的表达情况。miR-137能通过抑制线粒体自噬受体FUNDC1和NIX的表达，调节低氧诱导的线粒体自噬miR-137在PD患者血液中的表达显著高于对照组，据此推测，miR-137能抑制Parkin诱导的线粒体自噬，miR-137表达高，则Parkin诱导的线粒体自噬水平低，而细胞内低水平的自噬恰好是PD的诱因之一。研究发现，致病性LRRK2的miRNA活性抑制功能被神经元细胞命运决定簇TRIM32直接拮抗。说明miRNA活性抑制可能是防治PD的重要靶标[18]。

亦有学者发现，miR-124是一个高度表达于神经系统内的miRNA，其表达含量比其他组织的100倍还要丰富，在例如脑脊髓炎和胶质瘤疾病等神经系统疾病中表达下降，同时对于缺血性脑损伤和卒中等疾病具有显著的神经保护作用。王慧清[19]发现在MPTP帕金森病小鼠中脑组织和黑质区多巴胺能神经元内miR-124表达下降，另外MPP+刺激的SH-SY5Y细胞中miR-124表达也下降，提示miR-124可能为帕金森病早期诊断的一个生物标志物。利用侧脑室置管给药的方法，发现外源性给以miR-124激动剂后，MPTP帕金森病小鼠黑质区多巴胺能神经元缺失减少，中脑组织内的多巴胺水平下降减少，提示miR-124对帕金森病具有神经保护作用。Kanagaraj等[20]收集109例PD患者和40例年龄和性别匹配的健康志愿者(对照组)血清样品。提取包裹在血清中的外来体样微囊中的RNA，并逆转录。通过定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)分析血清miRNA，建立ROC曲线分析miRNA准确鉴别PD的能力。并进一步验证了miR-19b的下调和miR-195和miR-24在PD患者中的上调。与对照组比较，miR-19b、miR-24和miR-195的曲线下面积(AUC)值分别为0.753,0.908和0.697。因此，血清中miR-19b、miR-24和miR-195的表达水平可能对PD的诊断有益。

Wang等[21]从表观遗传学角度，研究微小RNA在患者和对照组的扣带回的表达。来自患者和对照组的744个具有良好表征的miRNAs在回旋曲线中的表达谱TaqMan阵列miRNA芯片。通过SYBR Green qRT-PCR验证显著失调的miRNAs。通过TaqMan阵列的第一个筛选鉴定了在患者的扣带回中上调的43个微小RNA。在这些microRNAs中，13个被预测调节以单基因形式的PD(DJ-1，PARK2，PINK1，LRRK2，SNCA和HTRA2)突变的6个基因中的至少一个。还发现这13种微RNA(miR-144，miR-199b，miR-221，miR-488, miR-544)中的5种被SYBR Green qRT-PCR上调，并被预测调节SNCA、PARK2、LRRK2或其组合。患者中SNCA、PARK2和LRRK2的表达减少。另外5个测试的潜在目标基因中有5个被下调。这些是由miR-199b、线粒体甲硫氨酸(MTFMT)的miR-221、锌指蛋白440(ZNF440)调控的由miR-144、Ellis Van Creveld蛋白(EVC)调节的DNA损伤调节的自噬调节剂1(DRAM) tRNA甲酰转移酶，由miR-544可能控制的miR-488和XIRP2(Xin肌动蛋白结合重复含有)。该研究确定了可能通过修饰SNCA、PARK2、LRRK2表达和其他方法在PD病因中发挥作用的五种微小RNA正常细胞功能所需的基因。

Liu等[22]应用人SK-N-SH神经母细胞瘤细胞与不同浓度的MPP+一起培养，诱导PD模型，然后分析miR-181a的表达。继而用miR-181a过表达、沉默后，观察自噬蛋白标记物(LC3II、LC3I和Beclin 1)和p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/c-Jun N-末端激酶(JNK)信号转导检测蛋白(p-p38、p38、p-JNK和JNK)以及细胞凋亡。随着MPP+浓度的升高，miR-181a的表达逐渐降低。与MPP++ miR-181a干扰组相比，miR-181a的过表达显著降低了LC3II/LC3I比例，Beclin1表达，细胞凋亡和p-p38和p-JNK的表达。这表明miR-181a通过抑制p38 MAPK/JNK途径调节PD中的凋亡和自噬。

显然，miRNA可能是早期诊断PD的一种敏感生物标志物，并且调控miRNA的表达有望延缓PD的疾病进展。

3 展 望

近年来，关于miRNA和自噬在神经退行性病变中的发病机制研究日益增多,可以肯定miRNA诱导细胞自噬、神经元凋亡是防治PD的有效靶点，但是关于miRNA具体通过什么信号途径，如何有效调控神经元自噬的问题目前都尚无定论，有待于深入分析和鉴定，亦有望为PD防治提供新的靶点。