浅谈Wnt/β-catenin与肾间质纤维化的关系＊

黄 伟 ，沈金峰 ，谢 娟 ，罗富里 ，晏子友

(1、江西中医药大学，南昌 330004；2、江西中医药大学附属医院，南昌 330006)

肾间质纤维化 （renal interstitial fibrosis，RIF）的形成和发展是一个动态的病理过程，涉及多种细胞因子和信号通路的异常表达调控，如Wnt/βcatenin通路、转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）、IGF 及 JAK/STAT 通路、PI3K 通路等[1]。其中以Wnt/β-catenin信号通路的研究较为深入。目前研究证实在肾组织发育中，Wnt/βcatenin信号通路是必需的分子信息传递系统，其表达异常与RIF存在相关联系，且目前尚无特效的治疗方法[2]。因此，深入研究Wnt/β－catenin信号通路在RIF形成中的关键作用，可为抗RIF的治疗提供新的可能途径及干预靶点。

1 Wnt/β-catenin信号转导通路概述

1.1 Wnt基因及信号转导通路 Wnt基因是在发现的wingless基因与int-1基因的基础上所命名。Wnt信号通路作为生物机体的一个重要信号通路，生理状态下，它按程序规律地激活和静止，是诱导生物正常组织分化的信号，参与胚胎进化及组织发育过程中的细胞增殖、极化与凋亡。根据信号转导的不同方式，可分为两条途径：经典Wnt/βcatenin 途径 (canonicalWnt/β-catenn signal pathway)和非经典的Wnt信号途径(noncanonical Wnt signal path-way)。

1.2 β-catenin的结构和生物学特性 Wnt/βcatenin信号通路的转导取决于细胞内β-catenin的水平。β-catenin蛋白在细胞中发挥着双重作用，在胞膜上与E－钙粘蛋白(E－cadherin)形成细胞黏附连接复合体(E－cadherin/β－catenin 复合体)，介导同型细胞间的黏附，防止细胞的迁移而发挥作用[3]。 同时 β－catenin 又是 Wnt/β－catenin 信号途径下游的关键效应因子，广泛存在于各种细胞中，如内皮细胞、成骨细胞、成纤维细胞，并参与了这些细胞的增殖、分化和凋亡等。在正常功能状态下，βcatenin被磷酸化降解，可使胞质内游离β-catenin浓度保持相对较低水平。此过程中起主要作用的是β-catenin降解复合物，它由Axin、结肠息肉病蛋白(adenomat-osis polyposis coli，APC)、 蛋 白激酶 2A(protein phosphatase 2A，PP2A)、GSK3、CKI组成，供GSK3黏附，促进β-catenin的磷酸化和降解。当机体受到体内外刺激时Wnt信号活化，可激活其下游因子，导致β-catenin降解减少，在胞质及胞核中聚集，调控Wnt信号通路的下游靶基因转录，影响细胞增殖、分化、迁移、凋亡等功能[4]。

1.3 Wnt/β-catenin信号通路核心效应因子 （βcatenin/TCF转录复合体）β-catenin入核后与核内转录因子T细胞因子TCF结合形成β-catenin/TCF转录复合体，实现对Wnt信号通路中下游基因的转录调控，进而发挥其生物学效应。在静息状态下，核内的TCF/LEF可在WRE序列上结合，并与转录抑制因子Groucho和CtBP结合，招募HDAC等一系列因子，抑制下游基因的转录，βcatenin入核后可取代Groucho等抑制因子，同时招募一系列转录辅助因子，开启下游基因的转录[5]。β-catenin与 Groucho/TLE竞争TCF分子的CRD区域，诱导转录抑制因子解离，TCF的转录抑制解除可为下一阶段转录激活做准备[6]。

2 Wnt/β-catenin信号转导通路与肾间质纤维化

Wnt信号通路在生物进化中具有高度保守性，当Wnt信号通路异常激活，将发生机体纤维化、肿瘤等病理改变。目前研究证实，Wnt/β-catenin通路在RIF的发生发展中发挥着重要作用[7]。上皮细胞-间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition，ETM)是形成RIF的重要途径，当发生ETM时，使细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)合成与降解平衡受到破坏，导致ECM在肾间质增多，进而发展至终末期慢性肾脏病。在正常细胞中Wnt信号通路是静默的[8]，Wnt信号通路在肾小管上皮细胞中处于抑制状态，且不能调节特定基因的表达。此时绝大部分的β-catenin处于复合体中，与E-cadherin等结合，致肾小管间充质细胞－上皮细胞转分化(mesenchymal－epithelial transition，MET）的发生[9]。王国勤等[10]采用单侧输尿管梗阻（Unilateral Ureteral Obstruction，UUO）小鼠动物模型观察Wnt7a蛋白拮抗RIF的作用机制时，发现术后7d与模型组相比，治疗组肾间质纤维化相对面积显著减少，α－平滑肌肌动蛋白 （α-smooth muscle actin，α-SMA）及波形蛋白的表达显著减少，E－钙粘素表达显著增多，而β－catenin表达较模型组显著减少 （P均＜0.05）。表明在 UUO动物模型中Wnt7a蛋白可抑制Wnt/β－catenin通路，抑制肾脏ETM的发生，从而减轻肾脏的纤维化。闵亚丽等[11]观察Wnt/β-catenin信号通路在肾缺血再灌注(Ischemia reperfusion injury，IRI） 致慢性RIF大鼠模型中的表达发现，IRI组大鼠肾组织β-catenin、Fibronectin、α-SMA蛋白表达水平较假手术组明显增高，肾功能减退，病理显示肾小管间质出现纤维化改变。他们还发现IRI术后7d肾脏纤维化尚不明显时肾组织β-catenin即有增高，在术后14d βcatenin增高更加显著。提示肾缺血再灌注致肾纤维化过程中Wnt/β-catenin信号通路激活，且早于RIF的出现。表明Wnt/β-catenin信号通路有可能在IRI所致RIF病程中发挥重要作用。叶伟标等[12]通过荧光定量PCR技术发现IgA肾病患者肾活检组织中miR-155表达水平显著高于对照组 （P＜0.01），而且miR-155表达量与RIF呈正相关；且通过体外细胞实验证实，上调miR-155表达可激活Wnt/β-catenin信号通路，增强间质表型标志物fibronectin表达，增加ETM，从而促进RIF的发生。在Wnt/β-catenin信号通路中已有部分靶基因被证实与RIF相关，如纤维连接蛋白(FN)、成纤维特异性蛋白1(Fsp1)、Snaill、基质金属蛋白酶7(MMP-7)、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)等都是通过Wnt/β-catenin信号通路介导的靶基因来对RIF产生影响[13]。林辉等[14]研究发现，当wnt信号通路激活后，活化的β-catenin迅速增多，并由胞质转向细胞核内，从而激活其下游基因如基质金属蛋自酶7(MMP7)的表达，而MMP7具有降解ECM的能力，从而抑制RIF的发生发展。

3 Wnt/β-catenin与其他信号通路交叉对话对RIF的影响

3.1 Wnt/β-catenin信号通路表达与 TGF-β/Smad的交叉对话 近年研究发现，Wnt/β-catenin信号通路不仅可以通过对靶基因的直接调控RIF，还可以通过与其他信号通路的交叉对话间接影响RIF。Wnt/β-catenin信号通路与TGF-β/Smad通路的联系在纤维化中发挥重要作用，现研究表明TGF-β的上调可促进RIF的进展，在TGF-β/smads通路中，TGF-β1与受体结合，活化的TGF-β1受体能够特异地识别和磷酸化Smad蛋白家庭成员Smad2和Smad3，R-Smads又与其伴侣分子Smad4结合，形成有功能的转录复合体，Smad3、Smad4可以与β-atenin和TCF/LEF结合，促进两信号间相互作用，引起靶基因的转录[15]。Wnt/β-catenin信号通过抑制GSK3-β使Smad3处于稳定状态，磷酸化Smad3的稳定又与高水平的Wnt/β-catenin信号直接相关。TGF-β/Smad信号通路与经典和非经典的Wnt信号通路可通过自分泌和旁分泌共同诱导上皮间质转化过程，并通过自分泌形式来维持其间质状态。故TGF-β和Wnt信号通路在成骨细胞、成纤维细胞、多能干细胞的分化及间充质干细胞的状态维持过程中都发挥极重要作用[16]。

3.2 Wnt/β-catenin信号通路表达与其他信号通路的交叉对话 诸如PI3K/Akt和JNK、周细胞等信号通路与Wnt/β-catenin信号通路之间都存在交联关系。TGF-β1促进Wnt蛋白的分泌，激活PI3K/Akt，直接磷酸化GSK－3β并抑制其活性，进而激活β-catenin/TCF转录复合体以及转录因子，促进EMT。Zhang等[17]发现 Wnt11能被 TGF-β 及 Smad3激活，Wnt11的功能由Wnt/JNK通路介导，其通过增强骨髓间充质标记基因活性介导RIF，当受体基因被敲除或受Wnt信号抑制剂干预，能逆转TGF-β对骨髓间充质标记基的表达。Kawakami等[18]在RIF动物模型中发现，肾周细胞向肌成纤维细胞分化时，Wnt信号通路高度激活，细胞表型发生间充质转化。周细胞可能向肌成纤维细胞转化，肌成纤维细胞的活化增殖，导致ECM大量合成，促进RIF的形成，肌成纤维细胞是肾间质中产生ECM最主要的细胞，周细胞是肌成纤维细胞的重要来源[19]。PI3K/Akt和JNK、周细胞信号通路可能是通过与Wnt/β-catenin信号通路的交叉对话实现其生物学效应，Wnt/β-catenin信号通路中存在这些信号通路的激活点，当Wnt/β-catenin信号激活时可同时激活上述信号通路，共同发挥这些通路的生物效应，但这些信号通路究竟与Wnt/β-catenin信号通路哪一节点发挥作用目前尚未完全阐明。

4 干预Wnt/β-catenin信号通路与抗肾间质纤维化

4.1 Wnt/β-catenin信号通路分子靶向抑制剂 近年来针对Wnt/β-catenin信号通路中相关细胞因子为靶点的抑制剂已逐渐成为抗肾脏纤维化治疗的新靶点。陈定国等[20]等研究发现DKK-1(Dickkopf-1)蛋白作为Wnt信号通路的抑制因子之一，可通过竞争性结合LRP5/6，也可通过与跨膜蛋自kremen、LRP5/6形成三元复合物而导致快速内吞，减少质膜LRP5/6而抑制Wnt信号通路，抑制肌成纤维细胞的活化及成纤维细胞特异蛋白、纤维连接蛋白的表达，在一定程度上能够减轻肾脏纤维化程度。陈华等[21]采用UUO小鼠动物模型探讨miR-200a对肾Wnt/β-catenin信号通路的影响，结果发现，术后第7d UUO组小鼠肾小管损伤、间质胶原沉积明显，Wnt4、β-catenin、Fibronectin、α-SMAmRNA 及蛋白表达较假手术组明显升高（P＜0.05）；而UUO+miR-200a组小鼠肾小管损伤、间质胶原沉积较UUO组明显减轻，Wnt4、β-catenin、Fibronectin、α-SMA 基因及蛋白表达也较UUO明显降低（P＜0.05）。表明在UUO模型中Wnt/β-catenin信号通路的激活，可致肾小管损伤，肾间质胶原沉积增多，促进RIF；miR-200a则能够抑制Wnt/β-catenin信号通路，缓解RIF，保护残存肾功能。彭华等[22]采用腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病肾病(DN)大鼠模型发现12周后辛伐他汀治疗组大鼠24h尿蛋白定量，血肌酐（Serum creatinine，SCr)、 尿素氮 （Blood urea nitrogen，BUN)显著降低（P＜0.05）；肾小管间质结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF）、βcatenin的表达明显下调（P＜0.05），肾组织病理改变明显减轻。说明辛伐他汀可能通过下调DN大鼠肾小管间质CTGF及β－catenin的表达来保护肾脏功能及延缓RIF。王曼等[23]采用UUO小鼠动物模型，予以丹酚酸 B（salvianolic acid B，SalB）治疗，结果发现术后第21d，SalB高、低剂量组小鼠肾脏中胶原Ⅰ型蛋白、α-SMA、TGF-β1的表达水平较模型组均有不同程度的下降（P＜0.01-0.05）；而 SalB高剂量组 E-cadherin 的表达水平则明显升高（P＜0.01），βcatenin和βp糖原合成激酶3β （glycogen synhase kinase-3，βp-GSK-3β）蛋白表达水平均显著下降（P均＜0.01），且高剂量组各项指标较低剂量组下降更为明显。表明SalB可通过下调Wnt/β-catenin通路中的 β-catenin、p-GSK-3β 水平来调控 Wnt/βcatenin信号通路，从而抑制UUO小鼠所致的RIF。

4.2 中医药制剂对Wnt/β-catenin信号通路的干预向玉琼[24]观察去甲斑蝥素（NCTD）对UUO大鼠及人近端肾小管HK-2纤维化模型Wnt/β-catenin表达的影响，发现假手术组大鼠肾脏β-catenin表达少，随着UUO大鼠梗阻时间延长，β-catenin蛋白表达逐渐升高，以术后14d表达最强；NCTD治疗组大鼠较对照组Wnt4、β-catenin蛋白及mRNA表达明显下降（P 均＜0.05）；与 TGF-β1 刺激组相比，NCTD 不同浓度干预组Wnt4、β-catenin蛋白表达下调，且呈浓度依赖（P＜0.05）。提示NCTD干预可以下调UUO大鼠肾组织及TGF-β1刺激的HK-2细胞中Wnt4和β-catenin的表达，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥抗RIF作用。付旭等[25]观察黄芪丹参颗粒药对UUO大鼠Wnt/β-catenin信号通路的作用机制发现，术后14d模型组大鼠24h尿蛋白和、α1-微球蛋白 （α1-Microglobulin，α1-MG）、 肾组织 Wnt4和β-catenin蛋白表达较正常组均明显升高（P均＜0.05）；而黄芪丹参颗粒各治疗组大鼠24h尿蛋白和、α1-微球蛋白（α1-Microglobulin，α1-MG）、肾组织Wnt4和β-catenin蛋白表达均较模型组明显降低（P均＜0.05），尤以中、高剂量组更显著。

综上所述，Wnt/β-catenin信号通路参与RIF的发生已经得到大量研究证实，但该信号转导通路的具体调控方式、与其他信号通路间的相互作用、参与该信号转导通路的各分子的生理作用以及各靶基因激活的后果和意义均有待进一步研究。随着对Wnt/β-catenin信号通路及其在RIF发生发展中的作用机制的深入研究，可以以该信号通路为切入点，通过调节Wnt/β-catenin信号通路来干预RIF的过程，为延缓肾功能恶化提供新的思路及治疗方向。

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