热应激对肉牛和肉羊生理生化指标及外周血miRNA表达水平的影响

彭孝坤，胡建宏，张恩平

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

热应激主要指动物机体所处外界环境温度超过了等热区中舒适区的上限，使动物机体热平衡遭到破坏，散热受阻，体温升高而导致产生非特异性防御应答反应[1-2]。当动物所处外界环境温度越高时，热应激反应程度就越严重[3]。热应激影响动物的生产性能、繁殖性能、自身免疫以及肉、蛋、奶等产品质量，严重影响养殖经济效益。以往热应激研究的重点一般集中在鸡、猪、奶牛等对热应激较为敏感的动物上，而对肉牛和肉羊(绵羊、山羊)研究较少，由于羊发生热应激的概率较小，故对羊的研究更少。羊属于恒温动物，虽然汗腺不发达，但羊毛有绝热作用，能阻止太阳辐射热迅速传到皮肤，故耐热性较好，特别是山羊有较宽的等热区和较高的耐热能力[4]，但外界环境温度过高时仍会产生热应激。

血液在维持机体内环境稳态中起重要作用，体内各代谢途径往往需要血液的调节，其生化指标的变化可体现机体各组织器官的不同生理状态。当动物产生热应激时，血液中相关的免疫指标、抗氧化指标、电解质、激素和酶等物质的含量往往会发生变化，导致动物机体抗氧化能力和免疫能力降低等[5]；血液中miRNA的表达十分稳定，常用作一些疾病、组织损伤的生物标志物[6-7]。miRNA对热应激状态下动物细胞增殖、分化、凋亡以及机体免疫、抗氧化应激、器官损伤、生长及繁殖性能等方面都起重要调控作用[8]。miRNA是热应激奶牛和肉牛血清中高度表达的调控因子，参与调控牛各组织器官免疫及抗氧化的进程[5，9]，但关于羊外周血miRNA的研究鲜有报道。本文对近年来热应激对牛外周血miRNA表达水平的影响进行综述，以期为外周血miRNA对肉羊热应激的调控机制研究提供思路和参考。

1　导致热应激的环境因素及评判标准

引发动物产生热应激的环境因素有多种，如外界环境温度、相对湿度、太阳辐射、降雨量、气流等[10-11]。动物处于热应激状态时，机体各种生理生化指标，如直肠温度、呼吸频率，血清中免疫相关指标、抗氧化指标等往往会发生一系列变化，其中某一种或多种指标可以判断动物是否处于热应激状态及其水平。Lemerle等[12]研究发现，通过测定奶牛的直肠温度和呼吸频率可以判断奶牛是否处于热应激状态及其热应激水平。赵波等[13]研究认为，由于热应激可以使奶牛体温和呼吸频率显著加快，故可以用体温测定法和呼吸频率法作为判定奶牛热应激的方法，测定一群正常奶牛的体温(如10头)，体温测定法评判标准为：如果有70%以上奶牛体温超过39.4 ℃，可判断奶牛已经开始处于热应激状态，如果体温超过40 ℃，可判断奶牛处于严重热应激状态；呼吸频率法评判标准为：如果有70%以上奶牛呼吸频率高于80次/min，可判断奶牛已经开始处于热应激状态，如果呼吸频率高于85次/min，可判断奶牛处于严重热应激状态。West等[14]研究表明，除动物机体自身指标外，一些其它参数，如动物体温、采食量、外界环境参数(有效温度、温湿指数等)也能说明动物是否处于热应激状态。目前，对奶牛热应激评判标准日益完善，Bohmannova等[15]研究表明，在高湿地区温湿指数(Temperature humidity index,THI)可以用来评价奶牛是否处于热应激，并形成了相关的计算公式：THI=0.72(Td+Tw)+40.6，其中Td为干球摄氏温度，Tw为湿球摄氏温度，评判标准为：热应激发生THI的临界值为72，THI≤72奶牛不发生热应激，7289奶牛处于重度热应激状态。也有研究表明，当THI>68时，奶牛的直肠温度、呼吸频率以及奶中体细胞数都大幅度上升，奶牛开始出现热应激反应[16]。肉牛热应激一般也以THI为依据，THI临界值的大小与牛品种、年龄、生长环境等因素有关。但针对羊热应激的评判标准鲜有报道。判断羊是否处于热应激状况，现在主要从生理状态和生理指标值判断，如心跳、呼吸频率加快，体温升高等。其中温度和湿度是影响肉羊热应激的主要因素，肉羊适宜温度为10～25 ℃，相对湿度为30%～70%，在适宜的温度和湿度下肉羊生长性能最好。温、湿度在适宜区间上下轻微浮动时，肉羊可以通过改变站立或躺卧姿势等行为，调整呼吸频率、产热量、采食量、饮水量等方式来维持机体产热和散热的平衡[17]，也能健康生长。温、湿度过高或过低都会影响肉羊的生长性能和生产性能，如环境温度过高会引起羊体表温度和直肠温度增加[18-19]，血液气体、酸碱平衡、电解质代谢等失衡[20]，生长和繁殖性能下降[21-22]，严重时甚至导致死亡[23]。湿度常常伴随温度一起对羊热应激起作用。颜培实等[24]研究表明，公羊在35 ℃的高温下，把相对湿度从57%增加到78%，体温可上升0.6 ℃，说明高湿对体温有影响。当所处外界环境温度相同时，低相对湿度可降低动物热应激，并提高动物的生长和生产性能[25-26]；但高相对湿度会加重动物热应激的程度[14，27]。

2　热应激条件下生理生化指标差异

2.1　热应激对呼吸频率和体温的影响

在生理指标中，呼吸频率和直肠温度是动物在夏季炎热天气中耐热性和适应性评价最常见的指标。当外界温度过高时，动物机体首先通过提高呼吸频率来加速散热，当机体通过自主性和行为性等体温调节机制散热较慢时，直肠和体表温度会升高。动物产生热应激后，表现为呼吸频率加快，直肠温度升高，导致体重、平均日增重、生长率等降低[14，27-28]。张庆茹等[29]研究发现，肉牛夏季热应激期间直肠温度(39.04 ℃)和呼吸频率(63.88次/min)极显著高于冬季非热应激期(37.41 ℃和23.08次/min)，表明热应激对肉牛直肠温度和呼吸频率有很大影响。羊正常呼吸频率约为12～30次/min。有研究表明，低温状态下，绵羊的呼吸频率为12～20次/min，山羊的呼吸频率为10～30次/min[30]，当外界环境温度由20℃提升到40 ℃时，山羊的呼吸频率可由30次/min提高到200次/min[31-32]，说明外界环境温度对羊的呼吸频率有很大的影响。Marai等[33]研究表明，当绵羊处于高温且高湿环境时，其呼吸频率会进一步增加，这与绵羊体感温度的增加有关。羊的正常直肠温度约为38～39.5 ℃，羔羊高出约0.5 ℃。当大多数家畜处于高温环境时，直肠温度每升高1 ℃甚至更小，生长或生产性能都会下降[34-35]。

2.2　热应激对血液电解质平衡的影响

正常状况下，血液是协调动物机体各组织代谢的主要途径，对体内电解质平衡、酸碱平衡及体温的恒定等都起很大的作用；当动物内环境稳态遭到破坏时，机体的酸碱与渗透压平衡会遭到破坏。牛和羊产生热应激后，其呼吸频率加快，引起血液中二氧化碳下降，进而导致酸碱失衡，易造成呼吸性碱中毒。动物产生热应激后，随着唾液的大量分泌或皮肤蒸发排汗的增加，血液中电解质如Na+、K+、Mg2+等离子可进一步流失[36]。有研究表明，热应激条件下肉牛血清K+、Ca2+、Na+均降低，血清Cl-显著升高。血清Cl-含量增加可能是热应激导致肉牛呼吸性碱中毒后，引起肾中碳酸氢盐分泌能力增强，使肾小管对Cl-的吸收增加，最终导致血清中Cl-含量增加[5]。热应激条件下，机体酸碱失衡，分泌大量有机酸，有机酸与Ca2+结合，导致血液中Ca2+浓度下降。李建国等[37]研究发现，奶牛夏季热应激期间血清中Ca2+浓度比冬、春、秋季等非热应激期间分别下降36.56%、27.26%和25.13%，说明热应激对血清中Ca2+浓度影响较大。Olsson等[32]研究表明，把山羊的环境温度从20 ℃提高到38.0～39.5 ℃，持续5.15 h，可观测到山羊血浆Na+浓度和摩尔渗透压浓度下降。热应激对动物血液中微量元素也能产生影响，如热应激状态下牛血液中微量元素Zn、Fe、Cr含量会下降，Cu、Mn、Co的含量会升高[38]。

2.3　热应激对血清激素水平的影响

热应激状态下，动物血清中激素水平会发生明显变化，主要体现在血清皮质醇(COR)、三碘甲状腺原激素(T3)、甲状腺素(T4)等激素的变化。COR是动物机体肾上腺皮质分泌的糖皮质激素，当动物处于不良环境时，前期COR的分泌量会增加，以提高其适应能力。宋小珍等[39]研究发现，肉牛处于热应激状态时，血清COR含量在热应激期第20天升高了49.30%，第40天升高了15.49%，第60天升高23.49%，说明热应激前期显著上升、后期逐渐恢复正常可能与肉牛自身的热适应调节有关；Gross等[40]研究发现，牛在急性热应激状态下血清COR含量会升高，慢性热应激时前期会升高，后期会下降趋于平衡。热应激状态下，动物体温升高，可激活下丘脑-垂体-甲状腺轴应激系统，甲状腺通过分泌T3和T4来控制代谢速率。有研究表明，湿热应激可导致藏绵羊和山羊血清T3和T4分泌减少[41]，以降低体内代谢产热。Koluman等[42]研究也表明，处于高温条件下的羊血清T3和T4浓度降低，可降低基础代谢率，避免内源性产热的增加。

2.4　热应激对血清酶类含量、抗氧化指标及免疫指标的影响

正常状态下，大多数酶类都处于细胞内，但当动物处于热应激状态时，细胞受损会使细胞膜通透性增加，大量的酶会进入血液中，因此检测血液中一些酶的含量变化可以作为判断心血管疾病、肿瘤、组织损伤等的标志。侯引绪等[43]研究表明，当牛处于热应激状态时，采食量会不足，对钙和磷的吸收会下降，血清中碱性磷酸酶(ALP)的含量会升高进而调节血钙的含量。正常状态下，动物机体内自由基的生成与清除维持在稳态水平和平衡状态，因而组织器官不会发生氧化应激而受到损伤；热应激状态下，自由基的生成超过了动物机体的清除能力，使氧化还原平衡发生紊乱，产生氧化应激，机体内抗氧化剂及抗氧化酶类的含量也往往会发生改变，抗氧化能力下降。胡煜等[5]研究表明，牛在热应激状态下，血清中总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)含量均降低，丙二醛(MDA)含量升高，可能是由于热应激破坏了机体的抗氧化防御体系，使得脂质过氧化物MDA含量升高，从而消耗了抗氧化酶的活性。宋小珍等[39]研究发现，肉牛血清中的MDA含量在热应激第20天升高了46.21%，第40天升高了67.59%；血清中SOD活性在热应激第20天降低了10.41%，第40天降低了14.41%，热应激比非热应激期间差异显著，说明热应激破坏了肉牛的抗氧化防御体系。井霞等[44]研究表明，热应激能降低牛外周血中T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核-巨噬细胞的比例，从而使机体免疫能力下降。Saker等[45]研究表明，当动物处于热应激状态时，热应激可通过影响神经内分泌的活动来影响机体的免疫功能，如热应激可引起下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴反应，促进促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、糖皮质激素(GC)等激素的分泌，进而抑制淋巴细胞的增殖，导致机体细胞免疫和体液免疫功能降低。张灿等[17,41]研究表明，湿热应激期内，藏绵羊和山羊血清中免疫球蛋白(IgA、IgG 和IgM)浓度显著降低，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度显著升高，且藏绵羊的变化幅度更大，说明藏绵羊的免疫功能比山羊受湿热应激影响更大。

3　热应激对miRNA表达的影响

3.1　miRNA与热应激的关系

miRNAs是一类长度约为22核苷酸的单链内源性非编码RNA分子[46-47]，哺乳动物miRNA不参与蛋白质的编码，其miRNA 5'UTR第2～8个碱基为种子序列，通过结合靶基因mRNA的特殊位点，并与Ago等蛋白形成沉默复合体(RISC)，作用到靶基因mRNA 3'UTR上，通过和靶基因mRNA 3'UTR碱基互补配对引导RISC抑制其翻译，从而对靶基因进行转录水平调控来参与动物机体的热应激调控。miRNA具有高度的保守性、时期特异性和组织特异性，因此可以精细地调节动物不同的生长发育阶段以及某些特定细胞和组织的靶基因表达[48-49]。哺乳动物miRNA 不仅可以存在于细胞的胞浆中，还能以外泌体，或与高密度脂蛋白相结合，或与Ago2 蛋白复合体相结合等形式存在血清、乳汁、尿液等细胞外或体液中，这类的miRNA我们称之为循环miRNA ，其中存在于血液中的miRNA成为外周血miRNA。血液中的miRNA表达十分稳定，可以作为疾病不同阶段的诊断和监测标志物[50]。有研究表明，miRNA在哺乳动物中基因转录水平尽管只有1%～5%能被编码，却可以调控机体内超过60%的基因[51-53]，参与了胰岛素分泌、信号转导等生理调节过程[54]。Mckenna等[55]研究表明，miRNA在细胞分化凋亡、生长发育、疾病发生等方面均起重要作用。越来越多的研究学者投入到对miRNA与热应激关系的研究中去，大量研究证实miRNA与热应激密切相关[56]。miRNA在畜禽抵抗热应激方面，在基因分子层面已经研究到调控热休克蛋白(HSP)、细胞凋亡、免疫调控、抗氧化应激、生产性能、相关代谢等基因方面[57-58]。目前miRNA在热应激方面的研究主要在牛、猪和肉鸡上，对肉羊的研究鲜有报道。

3.2　miRNA对细胞生长和凋亡的调控

冯亚杰等[59]对热应激条件下肉牛血液中表达差异的新miRNA进行靶基因预测和通路分析，发现环境信息处理的丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号途径被激活，差异性表达的miRNA参与机体细胞生长、发育、分化、凋亡等生命进程。MAPKs信号通路是哺乳动物非常重要的信号转导通路，当机体产生热应激时，MAPKs信号通路被激活，可将细胞外刺激信号转导至细胞内及其核内，并引起细胞生物学反应，调控机体一系列生物学功能变化。蔡明成等[60]研究热应激对肉牛外周血miRNAs表达的影响时将表达量显著上调和下调的10个miRNA进行靶基因预测，将相关靶基因进行GO和pathway分析时发现，miRNAs表达上调的靶基因主要参与调控细胞的生理代谢，如细胞增殖、凋亡等调节，还参与了MAPKs信号通路等蛋白激酶的级联反应；miRNAs表达下调的靶基因主要参与机体免疫功能的调节。 Collier等[61]用热应激诱导奶牛乳腺上皮细胞时发现，首先是热应答、DNA修复和蛋白质修复等相关基因上调，之后凋亡相关基因上调。Antonini等[62]研究表明，miR-34a、miR-34b可通过调控凋亡基因( p53)的表达来调控细胞凋亡。李惠侠等[63]研究表明，高温可以抑制奶牛乳腺上皮细胞内miR-24的表达，降低细胞凋亡率，促进乳腺上皮细胞的生长发育。有研究表明，某些miRNAs可调控生殖细胞发生、增殖和分化，如miR-4、miR-11 和miR-79等可作用于Bob，进而影响生殖细胞的发生[64-66]，miR-184在生殖干细胞分化、调节卵子发生和早期胚胎的发育中起重要作用[67]。有研究表明，miR-150的缺失可导致B1细胞增殖和增强体液免疫应答[68]。miR-181a和miR-486可能在B细胞受体通路、T细胞受体通路中发挥作用，通过调控其靶基因CD38、CD4等的表达来使T细胞活化和B细胞分泌[5]。

3.3　 miRNA对免疫和抗氧化的调控

Zheng等[69]利用RT-qPCR和高通量测序技术对热应激荷斯坦奶牛血清中差异表达的miRNA进行分析，发现其中有8个miRNAs(miR-19a、miR-19b、miR-27b、miR-30a-5p、miR-181a、miR-181b、miR-345-3p和miR-1246)在血清中高度表达，而且通过GO和KEGG通路分析得出这些miRNA所调控的靶基因在应激和免疫相关的信号通路上比较集中，表明这些miRNA与热应激反应密切相关，其中miR-19a 和miR-19b主要通过对靶基因热应激蛋白家族(HSP70家族)进行调控来参与动物机体热应激调节。HSP是一类非常重要的非特异性细胞保护蛋白，有抗氧化、协同免疫、抗细胞凋亡、分子伴侣等作用，在哺乳动物应激耐受和应激保护中起重要作用。刘延鑫等[70]指出HSP70基因的表达与牛耐热性存在相关性，表明HSP70 基因可以作为牛热应激反应的候选基因，其SNP位点可作为牛抗热应激的分子标记。Toll样受体(TLRs)是先天免疫系统中广泛表达的免疫蛋白，可构成机体免疫系统抵抗病原微生物入侵的第一道防线，TLR信号通路的过度激活将会导致过度的炎症和免疫反应，许多研究学者认为TLR信号的失调可作为炎症和自身免疫疾病的标志。胡朝恩等[71]认为miRNA可精细调节TLR信号通路的起始、终止和反应强度，对炎症和免疫相关性疾病的防止有重大意义，如miRNA可以通过TLR调节T细胞、B细胞、巨噬细胞等免疫细胞的发育、分化和功能，进而调控机体的免疫反应。郑月等[72]对热应激牛血清miRNA 高通量测序分析发现共有52个差异表达极显著 miRNA(P<0.01) ，选择4个候选miRNAs( miR-19a、miR-19b、miR-181a、miR-1246) 用RT-q PCR 检测验证，发现结果一致，其中miR-181a极显著下调(P<0.01)，通过生物信息学分析表明其靶基因在B细胞和T细胞受体信号通路富集，说明miR-181a可能通过B细胞和T细胞受体信号通路来调节牛热应激的发生过程，调控与免疫相关的关键调控因子TNF-α和CD38被激活或抑制进而提高或降低机体免疫力。胡煜等[5]研究发现，热应激状态下牛血清中氧化指标丙二醛(MDA)含量升高，说明牛抗氧化能力下降，且miR-1246表达量与MDA显著相关；免疫球蛋白IgA、IgG和炎症因子白细胞介素2(IL-2 )显著下降，且外周血中miR-181a和miR-486表达量与免疫指标(IgA、IgG、IL-2)显著相关，说明miR-1246、miR-181a和miR-486在牛热应激状态下参与了免疫应答和抗氧化等方面调控，可作为牛抗热应激的分子标志物。miRNA不仅广泛存在于动物和植物中，在微生物中也有存在。Demont等[73]研究表明，热应激状态下，益生菌中miR-27a的表达量与白细胞介素10(IL-10 )表达量显著相关，从miRNA角度在微生物中也揭示了一部分热应激引起免疫功能异常的机制。

4　小结与展望

miRNA作为一种转录后调控机制，在热应激条件下对细胞生长、凋亡、机体免疫和抗应激反应等方面发挥重要作用。综合众多miRNA与热应激关系的研究不难发现，miRNA在热应激、抗热应激和热应激标志物筛选中有巨大潜力。随着生活水平的提高，人们对肉牛和肉羊的需求量越来越高，肉牛和肉羊养殖规模不断扩大，健康养殖变得尤为重要，降低温热环境对肉牛和肉羊的影响是健康养殖的重要环节。为了提高生产效率，改善肉牛和肉羊品质，综合考虑温度、湿度、气流等温热环境因子，制定不同气候区典型肉牛和肉羊热应激评价体系，是当前和未来肉牛和肉羊健康养殖的技术需求。目前，关于肉牛和肉羊血液miRNA的研究很少，探索肉牛和肉羊的热应激机制及筛选热应激标志物也是肉牛和肉羊环境生理研究的方向。

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