EB病毒编码microRNAs生物学功能的研究进展

陈美慧，李 晶，胡文佳，黄 辉，陈 晨，周克元，李祥勇

广东医科大学 生物化学与分子生物学研究所，广东湛江 524023

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是一种普遍存在于人类淋巴细胞的疱疹病毒，最初发现于霍奇金病淋巴瘤的原代细胞培养过程中。已有研究表明，EBV是引起人类癌症的主要病毒之一，与人类Burkitt's淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等恶性肿瘤的发生发展密切相关[1-6]。EBV是第一个被发现可以编码miRNAs的人类病毒，近年来的大量研究表明EBV可通过表达多种miRNAs在病毒感染、细胞凋亡、免疫逃逸和重要信号通路等方面发挥重要的生物学功能。本文具体阐述了EBV microRNAs的合成及作用机制，旨在为EBV感染相关疾病的治疗研究提供新的资料。

1 EBV miRNAs的合成

miRNAs是一类约22个核苷酸组成的非编码小RNA，通过与靶mRNAs分子的3'端非编码区域(3'-untranslated region，3'UTR)不完全互补配对的方式识别靶mRNA，利用RNAi沉默机制调控基因的转录后表达。大多数miRNA基因在细胞核中由RNA聚合酶Ⅱ转录生成具有茎-环二级结构的pri-miRNAs，pri-miRNAs经封顶、拼接、腺苷化[7]。随之pri-miRNAs经过微处理复合物(microprocessor)处理后形成65 ～ 70 bp的发卡状小分子RNA(即Pre-miRNA前体)，该微处理复合体由核糖核酸酶ⅢDrosha和亚基DGCR8组成[8]。Pre-miRNAs由输出蛋白5(exportin 5，XPO5)和5'-三磷酸鸟苷作用完成胞核到胞质的运输转移[9]，在胞质中经DICER1(一种核糖核酸酶Ⅲ)处理形成成熟的双链miRNAs，包括导向链和随从链，前者与DICER1、AGO蛋白结合形成沉默复合体(miRNA-induced silencing complex，miRISC)后，通过与靶mRNA结合进而抑制翻译起始或者通过引起mRNA的降解抑制蛋白的合成[10-12]。目前认为miRNAs与许多疾病的发展密切相关，特别是肿瘤。

2004年，Pfeffer等[13]首次发现EBV病毒可编码出BART miRNAs。截至目前，研究表明EBV编码至少44种miRNAs，它们分别位于病毒基因组中BHRF1和BART两个区域[14]，而且这两类miRNAs的表达水平与细胞的病毒感染程度和细胞类型密切相关。相对于BART miRNAs可表达于病毒潜伏感染的所有时期，BHRF1 miRNAs则几乎完全表达于潜伏感染Ⅲ期；BART miRNAs虽然表达于所有EBV感染的相关肿瘤(包括鼻咽癌)，但其表达水平取决于受感染的细胞类型，研究发现BART miRNAs在上皮细胞的表达较其在B细胞的表达高出几个数量级[15]。

2 EBV miRNAs对病毒感染的作用

研究发现EBV miRNAs在病毒周期中扮演着重要的角色，它可以靶向多种病毒编码mRNAs的3'UTR。Barths等[16]发现miR-BART2-5p可以下调病毒DNA聚合酶BALF5的表达。Lo等[17]认为LMP1是miR-BART17-5p、miR-BART1-5p和miR-BART16的靶点，体外转染后可减少外源性LMP1的合成，进而降低细胞毒性，抑制细胞凋亡。同时，LMP1还 是miR-BART19-5p、miR-BART5-5p、miR-BART3、miRBART5和miR-BART20的作用靶点[18-19]，与病毒的潜伏感染密切相关。此外，Jung等[20]的研究表明miR-BART20-5p可作用于BZLF1和BRLF1，在维持EBV于潜伏感染状态和抑制其裂解激活等方面发挥重要作用。病毒miRNAs调控细胞溶素mRNAs可稳定或维持宿主细胞处于病毒感染潜伏期，且潜伏期相关的病毒基因的表达同样也受病毒miRNAs调节。

3 EBV miRNAs在免疫逃避方面的作用

目前普遍认为EBV感染宿主细胞后可通过作用于一些细胞因子参与免疫反应，进而逃避宿主的免疫防御。干扰素诱导的T细胞α趋化因子(CXCL11/I-TAC)是第一个被报道的EBV miRNAs的胞内靶点，其可选择性地结合T细胞趋化因子受体(CXCR3)。Pfeffer等[13]发现miR-BHRF1-3p的靶点为CXCL11 3'UTR的三个结合位点。同时Xia等[21]的研究发现抑制miR-BHRF1-3的表达可促进EBV+淋巴瘤细胞CXCL11 mRNA的合成，结果表明miR-BHRF1-3p可直接或间接地调控CXCL11的表达。此外Haneklaus等[22]研究表明miR-BART15可以通过感染淋巴B细胞的外泌体抑制未感染细胞的NLRP3炎症小体形成和IL-1β的合成。进一步的研究发现，自然杀伤(NK)细胞活化受体MICB是一种应急诱导的配体蛋白，已被证明是miR-BART2-5p的靶点，同时也发现miR-BART2-5p是机体感染EBV期间引起免疫逃逸的原因[23]。EBV感染的个体会对EB病毒产生强烈的免疫反应，尤其是细胞毒性CD8+T细胞，然而病毒感染从未被清除。Albanese等[24]发现EBV miRNAs可以通过多种分子和机制干扰细胞毒性CD8+T细胞识别及清除EBV感染细胞，这可能是EBV实现免疫逃逸的机制。IL-1信号在病毒感染后的炎症和宿主先天免疫反应的早期激活中起着重要的作用。Skinner等[25]发现EBV miRNA在EBV感染过程中降低IL-1受体1水平，从而改变了细胞对IL-1刺激的反应，并改变了受感染细胞数量的细胞因子表达水平。

4 EBV miRNAs在细胞凋亡方面的作用

在EBV编码的miRNAs中，miR-BARTs被认为与细胞凋亡密切相关，表现出明显的抗凋亡作用。2015年，Kang等[26]研究认为miR-BARTs在EB病毒感染的上皮细胞中发挥抗凋亡作用，其作用靶基因大多为促凋亡因子(如Bim)或凋亡相关基因受体(如Bax受体TOM22)。与此同时，Marquitz等[27]的研究也证实了BART miRNAs在抗凋亡刺激方面的作用。此外，Bad是一种Bcl-2家族促凋亡基因，Kim等[28]发现miR-BART20-5p通过调控促凋亡基因Bad的表达发挥抑凋亡的作用。最近的研究发现，凋亡终末剪切 酶Caspase 3是EBV miR-BART1、miR-BART16和miRBART22的直接靶点[29]，可有效地抑制内源性Caspase 3的表达，从而抑制细胞发生凋亡。MAP3K5也被称为凋亡信号调节激酶1(ASK1)，是P38MAPK通路中重要的早期应答基因和与细胞凋亡相关的基因。Chen等[30]研究发现MAP3K5是miR-BART22的作用靶点，后者可通过与MAP3K5 mRNA的3'UTR结合，导致MAP3K5表达下调，进而抑制细胞凋亡的发生。另外，miR-BART-6-3p通过下调PTEN的表达，从而抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤细胞的生长[31]。

5 EBV miRNAs在信号转导通路方面的作用

NF-κB信号介导慢性炎症导致持续的EBV感染、免疫系统感染细胞的免疫逃逸和代谢重组、癌症干细胞(CSCs)的形成[1,32]。EBV BART miRNAs可通过抑制LMP1的表达改变NF-κB信号通路。在LMP1表达缺失的情况下，过表达miR-BART3或miR-BART1抑制NF-κB激活并保持IκBa的稳定[18]。同时，NF-κB信号通路的相关蛋白如PELI1、cIAP1/XIAP、cIAP2/BIRC3、CYLD、A20/TNFAIP3、IKKa/CHUK和NFKBIZ等被证实是多个EBV miRNAs的靶点[18,33]，这些靶点在NF-κB信号通路中起着激活剂或抑制剂的作用。EBV miRNAs通过改变NF-κB信号通路，影响机体的免疫反应和肿瘤的形成。大量的研究表明Wnt信号通路调控细胞的分化过程[34]、肿瘤的干细胞形成[35]、肿瘤微环境[36]、上皮间质转化[37]、自噬[38]等。miR-BART14和miR-BART18-5p的靶点NLK均是Wnt信号通路的拮抗剂，当瞬时表达BART miRNAs时，其对应靶点的转录水平和蛋白水平均明显下调[39]。

6 EBV miRNAs在肿瘤转移侵袭方面的影响

研究发现EBV miRNAs在相关肿瘤的侵袭转移过程也发挥重要作用。Cai等[40]研究发现EBV-miR-BART7-3p的作用靶点是抑癌基因PTEN，EBV-miR-BART1通过抑制PTEN的表达可激活依赖PTEN的信号通路，进而促进鼻咽癌细胞的转移及侵袭能力。上皮间质转化(epithelialmesenchymal transition，EMT)与肿瘤的侵袭转移密切相关。研究发现EBV-miR-BART10-3p和MiR-BART9可通过调控EMT过程进而影响肿瘤的侵袭转移[41-42]。此外，也有研究表明miR-BART22可靶向作用于MAP3K5促进鼻咽癌细胞的侵袭能力[30]；He等[43]发现miR-BART6-3p可靶向作用于LucRNA LOC553103影响肿瘤的转移能力。

7 结语

EBV miRNAs自被认识以来，其在病毒的感染、肿瘤的发生等过程中扮演的角色已成为大家深入研究的热门课题。随着研究的深入，EBV miRNAs的作用新靶点被不断发现，其功能被不断地完善与补充。近期研究认为EBV-miR-BHRF1-2和EBV-miR-BART7-3p在细胞生长及周期阻滞等方面起着重要的作用[44-45]。同时，Gao等[46]研究发现miR-BART-7可以调控鼻咽癌细胞的放疗敏感性。此外，根据KEGG和Panther数据库分析，EBV BART miRNAs还可通过调控靶点基因的表达，在DNA损伤修复、整合素信号、硫酸乙酰肝素合成、泛素介导的蛋白水解和细胞缝隙连接等过程中发挥重要的调控作用。目前认为EBV miRNAs主要通过影响细胞内一些重要的信号通路在肿瘤的发生与发展中发挥着不可或缺的作用。随着高通量测序技术和生物信息学方法的快速发展及广泛应用，不断有新的miRNAs靶基因被发现，miRNAs对应的靶点和靶基因对应的miRNAs都可能不是唯一的，因此绘制EBV miRNAs与靶基因之间的调控网络就显得尤为重要。未来的研究方向应该从EBV miRNAs的协同作用及整体效应出发，注重于miRNA靶点相关信号通路的研究和EBV相关疾病决定性miRNA靶点的确定，这将有助于为EBV相关疾病的治疗提供新的思路。

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