我国鸡球虫病疫苗研究进展*

张思新 汤新明 李 超 刘贤勇 吕艳丽 索 勋

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)

鸡球虫病是一种由艾美耳球虫引起的寄生性原虫病(Shirleyetal.,2004)，该病以出血性肠炎、血痢、雏鸡发病率高和死亡率高为特征，给养殖业造成了严重的危害(Dallouletal., 2006;李仁良等, 2010)，据统计全世界养殖业每年因球虫病造成的损失大约30亿美元(Williams., 1999; Blakeetal., 2014)。当前国内外主要使用药物来控制球虫病，但由于耐药虫株的出现、药物残留以及新药研发成本高且周期长等问题严重制约了药物的应用(钱根林等, 2013;Clarkeetal., 2014)。目前实际生产中，球虫病疫苗是唯一替代药物有效防治球虫病的举措(Chapmanetal., 2002)。在球虫病疫苗的研制方面我国学者做了大量的工作，进行了广泛而深入的研究，本文主要就我国球虫病疫苗的研究情况作一概述。

1 活疫苗

球虫活卵囊疫苗是实际生产中防控球虫病的重要手段之一，目前国内外有关球虫病疫苗的研究主要以活苗为主, 分为强毒疫苗、弱毒疫苗、晚熟系球虫苗和早、中、晚熟系联合球虫苗4类。

1.1 强毒疫苗

强毒疫苗的虫株是直接从自然感染球虫的鸡体内或粪便中分离出来的，然后采用单卵囊分离技术分离并纯化单个球虫种，再按一定比例混合，并配以适当的稳定剂，即组成强毒活虫苗(索勋等, 1998)。Edgar通过饮水或拌料的方式给4～10 日龄鸡接种少量混合鸡球虫卵囊，取得较好的免疫保护效果(Edgaretal., 1954)。在强毒疫苗的研究过程中，王宗仪等(1988)发现，与初次感染大剂量卵囊相比，通过依次增加卵囊数量并反复轻微感染雏鸡, 不仅对宿主机体无影响, 且能获得良好的免疫保护。陈明勇等(1992)报道，E．tenella单虫种活苗经涓滴免疫、大剂量一次免疫和二次免疫均可获得较高的免疫保护力，且引起机体的免疫应答类型不一样，涓滴免疫能引起雏鸡以细胞免疫为主的免疫应答，而大剂量一次免疫和二次免疫则引起雏鸡以体液介导免疫为主的免疫应答。在实验条件下研究了鸡球虫苗1号(LCV-1)、鸡球虫苗(LCV-2)和四价鸡球虫疫苗(LCV)的免疫效果，发现鸡球虫苗LCV安全性高、免疫保护效果显著(闫鸿斌等,2006; 2008; 2009)。

强毒疫苗虽然能激发宿主产生足够的保护力，但在使用过程中也存在一定的风险：(1)强毒疫苗在制作和使用过程中不使用抗球虫药，如免疫不当，可能会引起球虫病；(2)强毒疫苗中的混合球虫是野生毒株，未经任何致弱处理，毒力较强，如使用不当可能会引起球虫病；(3)强毒疫苗是由地方性毒株组成，若不谨慎使用，引入新的鸡场，引起当地球虫病暴发。

1.2 弱毒疫苗

弱毒活苗是从自然感染的鸡粪便中收集卵囊， 采用单卵囊扩增法来纯化卵囊, 然后通过减弱虫株的致病性, 降低对宿主的危害性, 并能产生足够的免疫力的致弱虫株, 按一定比例配以适当的稳定剂而组成的一种活疫苗(索勋等, 1998)。目前致弱的方法有早熟选育、鸡胚传代和理化处理等几种。

1.2.1早熟选育: 1975年Jeffers 首次实现了柔嫩艾美耳球虫的早熟选育，并发现早熟株较亲本毒株致病力减弱, 但仍保持亲本株的免疫原性(Jeffers, 1975),这极大地推动了弱毒疫苗的发展。研究发现经过20代的早熟选育，获得潜隐期缩短16 h的巨型艾美耳球虫早熟株比其亲代株繁殖力下降了74%，致病力明显降低，但仍保持了免疫原性(王江清等, 1991)。经过12代早熟选育获得潜隐期74 h的两株堆型艾美耳球虫早熟株(P9株：裂殖生殖为3代和P12株：裂殖生殖为2代)，早熟株在繁殖力和致病力方面与亲代株相比均降低，但仍保持良好的免疫原性(秦建华等, 1992)。采用早熟选育方法获得潜隐期缩短21和26 h的柔嫩艾美耳球虫早熟株和毒害艾美耳球虫早熟株，早熟株的致病性大大降低，小剂量感染对增重无影响，大剂量感染也不会引起死亡，同时保持了良好的免疫原性(段嘉树等, 1993)。2007年正典研制的含柔嫩、毒害、巨型和堆型艾美耳球虫的四价鸡球虫活疫苗获得农业部新兽药证书。

1.2.2鸡胚传代: 将鸡球虫孢子化卵囊在体外进行人工脱囊, 获得子孢子, 再将球虫子孢子接种到鸡胚绒毛尿囊膜上培养, 连续传代多次, 可获得致病性降低, 但免疫原性仍良好的所谓“鸡胚适应株” (索勋等, 1998)。Long 等(1965)首次用柔嫩艾美耳球虫培养出鸡胚致弱虫株—“TA”株。经过连续传代, “TA”株致病力显著低于亲本株, 且免疫后能抵抗强毒的攻击。我国学者在1977—1987年通过鸡胚培育传代致弱方法，制成柔嫩艾美耳球虫弱毒活虫苗，并系列报道了该弱毒活虫苗的最小免疫剂量、免疫力产生期、安全性、稳定性、免疫期以及田间免疫试验(杨振中等, 1987a; 1987b；1990)。樊生超等采用柔嫩艾美耳球虫鸡胚适应株和巨型艾美耳球虫早熟选育株，按不同的配比制成混合球虫苗，免疫雏鸡，分别于免疫后第2、4、6、8周用强毒卵囊攻毒。与对照组相比，免疫鸡肠道病变轻微，增重明显，肠道内容物卵囊密度显著降低，获得较好的免疫效果(樊生超等,1997)。

1.2.3理化处理: 采用各种物理和化学手段, 如加热、冷冻、辐射、化学诱变剂等对球虫卵囊进行处理, 以便使卵囊的毒力降低(索勋等, 1998)。吴兆敏等(1991)用化学诱变剂N-甲基-N’-硝基-N亚硝基胍处理(5 μg/120 min或10 μg/60 min)后的柔嫩艾美耳球虫免疫雏鸡(2×103～8×103)，然后用2×105强毒株攻毒，发现鸡群无任何临床症状，保护率高达100%。中国农业科学院上海兽医研究所采用化学和物理双重致弱方法研制的鸡球虫病多价疫苗(DLV疫苗：柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫)是国内第一个获得新兽药证书的鸡球虫苗，并在实验室及田间试验取得很好的应用效果和效益(苏华炜等, 1996; 苏华炜等, 1997; 姚惠娟等, 2004)。

弱毒疫苗相比强毒疫苗，致病性显著下降，且仍保持了良好的免疫原性。但也存在一些不足：(1)弱毒疫苗的制作工艺繁琐，耗时耗力；(2)弱毒疫苗虫株的繁殖力相比亲本株明显下降，导致研制成本增加；(3)致弱虫株存在致弱性能不稳定，毒力返强等潜在因素。

1.3 晚熟疫苗

索勋等(1996)利用“时间递增传代法”,即每代间隔加8 h的方法,经过14代的选育，首次获得比亲本株卵囊高峰期延长1 d的柔嫩艾美耳球虫晚熟株。接种同剂量(200/只)的早熟、中熟和晚熟虫株，再攻毒后晚熟株的免疫效果最好。有学者经过16次传代, 获得了排卵囊高峰较母株(中熟系)推迟了2 d的毒害艾美耳球虫晚熟株, 且具有较好的稳定性。在生活史和生物学特性方面：晚熟系生活史各阶段虫体均比母株大，卵囊潜隐期不变，同等剂量晚熟株系的繁殖力高于中熟系；在同等剂量免疫下，晚熟系的致病性与中熟系相当，但免疫原性好于中熟系，攻虫后卵囊排出减少率在99%以上(董辉等, 2003a; 2003b)。

1.4 早、中、晚熟系疫苗:强效牌艾美耳球虫疫苗

索勋等于1996 年推出由早、中、晚熟系球虫联合制成的球虫苗———强效艾美耳牌鸡球虫苗(Einerivac Plus)并报道了强效艾美耳牌球虫苗的免疫效果(索勋等, 2000)。后来有学者进行了强效牌艾美耳球虫生物免疫毒力、安全范围的测定(雷江红等, 1999; 索勋等, 2000)。

活疫苗在防控球虫病的过程中发挥了重要作用，但活卵囊疫苗存在散播病原、制作工艺繁琐和稳定性等问题。在近十几年里, 随着分子生物学和基因组学的发展，许多研究者将关注点集中在基因工程疫苗的研究上。

2 DNA疫苗

自1990年Wolff等人发现裸DNA可以在肌肉细胞内表达以来(Wolffetal., 1990)，DNA疫苗越来越受到青睐。在球虫病DNA疫苗研究过程中，我国科研工作者做了大量工作。候选抗原的选择：由于球虫生活史复杂，发育阶段多，保护性抗原多。目前疫苗选择主要集中于折光体、微线、棒状体等细胞器抗原、虫体(子孢子、裂殖子和配子体)表面抗原和一些酶类抗原。如SO7(Songetal., 2013)、Mic家族蛋白(Shietal., 2014；Huangetal., 2015;)、cSZ-2(Shahetal., 2010)、3-1E(扈炳新等, 2011; Maetal., 2011)、TA4(Songetal.,2017)、Gam56(Xuetal., 2013)、Rhomboid(Liuetal., 2013)、pEtK2(张步彩等, 2008)和GAPDH(Tianetal., 2017)等。免疫接种剂量：在免疫接种时，免疫接种剂量不同对免疫效果有一定的影响。赵月兰等将构建的堆型艾美耳球虫3-1E基因核酸疫苗，分别设25、50和100 μg三个剂量进行免疫实验，攻毒后发现50 μg免疫组卵囊减少率达到67.67%，抗球虫指数(ACI)达到167.06，而25 μg免疫组为54.89%和146.59；100 μg免疫组为60.34%和148.88。表明50 μg产生较强的抗球虫效果(赵月兰等, 2011)。Song等(2017)将核酸疫苗pVAX1.0-TA4-IL-2设了6个剂量组，分别为2、15、25、50、100和200 μg进行免疫攻毒，发现25 μg剂量组免疫效果最佳，其ACI达到194.42。免疫途径的选择：免疫途径不同，引起的免疫应答，因此选择合适的免疫途径，所产生的免疫效果可能更好。Song等(2009)将pcDNA3.1b-TA4-chIL-2通过皮下注射、口服、肌肉注射、静脉注射和滴鼻等多种途径免疫鸡，攻毒后发现肌肉注射的方式免疫效果更佳，ACI最高，达到193.97。Kopko等(2000)将E．tenellaS07基因连接到真核表达载体pcDNA3.1上，构建了pcDNA3-S07质粒，直接肌肉注射免疫鸡，发现其盲肠病变的减轻和相对体重的增加均优于用活卵囊和重组蛋白抗原(CheY-S07)免疫的鸡。免疫佐剂的应用：免疫佐剂是构建疫苗的重要组成部分，它能提高抗原的免疫原性，产生更好的免疫保护。吴绍强等(2004)将表达柔嫩艾美耳球虫的TA4抗原的核酸疫苗，联合重组干扰素，以中剂量(50 μg)免疫时，鸡的增重效果最为明显，盲肠病变值也最小，ACI达到167.2。将柔嫩艾美耳球虫TA抗原和鸡IL-2制成核酸疫苗,免疫鸡两次，攻毒后发现pcDNA-TA4-IL-2免疫组的卵囊较少率为75.1%，ACI为192均高于pcDNA-TA4免疫组和pcDNA-IL-2组(Xuetal., 2008)。Geriletu将鸡IL-17基因与柔嫩艾美耳球虫的MZ5-7基因插入表达真核载体pcDNA4.0中，构建成核酸疫苗pcDNA4.0-MZ5-7-IL17,免疫鸡后攻毒发现卵囊减少率达到65.99%，ACI达到190，高于pcDNA4.0-MZ5-7的60.4%(卵囊减少率)和186(ACI)(Geriletuetal., 2011)。

虽然我们在DNA疫苗的研究中取得了一定的进展，但由于DNA疫苗的保护性试验是在实验室条件下进行，考虑到外界环境、地方虫株本身、免疫佐剂、免疫剂量和攻毒剂量不一等因素，试验结果需要进行田间试验进行进一步考证。

3 亚单位疫苗

在亚单位疫苗研究中，我国科研工作者也进行了深入地探索研究。周赛等(2013)用重组酵母表达柔嫩艾美耳球虫Mic4-N端蛋白与AbISCO©-100佐剂结合后免疫鸡，发现10 μg蛋白+50 μg佐剂组卵囊减少率为67.90%，而 1 μg蛋白+50 μg佐剂组和5 μg蛋白+50 μg佐剂组卵囊减少率分别为39.64%和36.85%，证明免疫剂量是影响抗球虫效果的因素之一。将柔嫩艾美耳球虫的TA抗原、毒害艾美耳球虫的NA4抗原、堆型艾美耳球虫的LDH抗原和巨型艾美耳球虫的Em8抗原组成多价亚单位疫苗，免疫鸡后分别以4种球虫攻毒，发现ACI均在170以上，表明在混合感染时，多价疫苗可以产生较好的免疫保护效果(Songetal., 2015)。将表达的柔嫩艾美耳球虫IMP1和CD40 L重组蛋白免疫鸡后，发现IMP1和CD40 L免疫组产生较好的体液和细胞免疫应答同时盲肠病变计分和体增重结果均优于IMP1与佐剂免疫组，表明CD40 L能增强IMP1的免疫原性，增强免疫效果(Yinetal., 2015)。重组的柔嫩艾美耳球虫的RHO1蛋白免疫鸡后，免疫组的IL-2、IFN-γ的表达水平和CD4+、CD8+T细胞的比例显著高于对照组，攻毒后免疫组的保护效率达到77.3%，证明RHO1基因具有良好的免疫原性，具有疫苗开发潜力(Lietal., 2012)。同时在SO7(许金俊等, 2007)、3-1E(扈炳新等, 2010)、SAG(Liuetal., 2018)、HSP70(陈珊等, 2008)、Serpin(李文超等, 2013)和5401(Duetal., 2005)等一系列抗原进行了尝试，取得了一定的成果。但目前市售的亚单位疫苗只有配子体亚单位疫苗COXABIC。因此在亚单位疫苗的研究的道路上，我们依然任重而道远。

4 活载体疫苗

活载体疫苗是将目的抗原的编码基因通过基因工程技术导入活载体 (弱毒的细菌或病毒), 构建重组菌 (毒) 株, 从而诱发相应的免疫应答。目前在球虫病活载体疫苗研究中我国工作者主要集中在细菌、病毒和球虫活载体疫苗研究中。

4.1 细菌活载体疫苗

细菌具有易于体外培养，转染和筛选系统相对简单和稳定，外源基因容量大，刺激宿主产生高质量免疫应答等优点(Beitelsheesetal., 2016)，目前应用到球虫上的细菌载体有沙门氏菌、卡介苗、乳酸菌和枯草杆菌等。杜爱芳等以DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)和转录激活因子(phoP)双基因突变减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111株为载体，表达了柔嫩艾美耳球虫5401基因，将菌株口服接种于3日龄的鸡，免疫两次，结果表明重组ZJ111/pcDNA3-5401菌既能诱导产生针对球虫的抗体，也能显著增强淋巴细胞增殖水平，其ACI达到164.98(杜爱芳等, 2006)，表明减毒沙门氏菌作为载体疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性。李云娜等将构建的重组卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF疫苗通过滴鼻、口服、颈部皮下注射3种途径接种雏鸡，发现重组卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF采用滴鼻方式免疫效果较好，ACI值分别为161.47和169.21(李运娜等, 2012)。Wang等(2014)分别构建了表达柔嫩艾美耳球虫rhomboid基因的pMV361-rho和pMV361-rho-IL2重组卡介苗，免疫两次，发现pMV361-rho-IL2和pMV361-rho均能显著增强淋巴细胞增殖水平,攻毒后其卵囊减少率分别为64.1%和51.6%。说明卡介苗能作为载体疫苗具有较好的免疫效果，同时细胞因子IL-2作为佐剂能提高抗原的免疫原性，增强免疫效果。将表达柔嫩艾美耳球虫AMA1基因导入乳酸菌表达载体并将重组菌免疫鸡，结果显示与对照组相比免疫组鸡的抗体水平和CD4+T细胞比例显著提高，攻毒后卵囊减少率达到33.33%(Lietal., 2018)。用芽孢杆菌饲喂雏鸡，攻毒后发现鸡的盲肠病变记分降低，体重增加，表明芽孢杆菌具有作为疫苗载体的潜力(Leeetal., 2010)。将表达柔嫩艾美耳球虫表面抗原3-1E的基因的重组枯草芽孢杆菌免疫肉鸡，攻毒后发现免疫组盲肠病变记分显著降低，体重明显增加，卵囊减少率达到63.70%，ACI为189(余东游等, 2014)，表明芽孢杆菌作为活载体疫苗具有较好的免疫保护效果。

4.2 病毒活载体疫苗

病毒载体具有安全性高、操作简便、免疫效力高等优点，因此以病毒为疫苗载体的研究发展迅速。杨桂连等将柔嫩艾美耳球虫的Rhomboid基因导入鸡痘病毒中获得鸡痘重组病毒rFPV-Rhomboid,免疫雏鸡，发现重组病毒接种鸡外周血中的CD4+、CD8+T细胞的比例和增重效果显著高于未免疫对照组，攻毒后也具有一定的保护作用(杨桂连等, 2006)。表明鸡痘病毒作为活载体疫苗具有较好的应用前景。

4.3 球虫活载体疫苗

基于活卵囊球虫疫苗的广泛应用、转基因技术的发展和球虫自身的“优势”，我们课题组提出以活卵囊球虫为疫苗载体表达外源抗原，从而实现一苗多用的目的。目前也取得了丰硕的成果。Kelleher等(1998)首先利用Mic1蛋白启动子实现了β-半乳糖苷酶在柔嫩艾美耳球虫的瞬时转染，拉开了球虫转染的序幕。利用荧光蛋白作为报告基因，在柔嫩艾美耳球虫的稳定转染获得了成功，证明了球虫转染的稳定性(Yanetal., 2009)。利用限制性内切酶介导的整合转染效率，显著提高了球虫的转染效率(Liuetal., 2008)。将表达巨型艾美耳球虫的IMP1和profilin抗原的转基因柔嫩艾美耳球虫免疫鸡，发现转基因球虫免疫组不仅能产生针对IMP1和profilin的体液和细胞免疫应答，而且用巨型艾美耳球虫攻毒后，可产生一定的免疫保护，免疫组卵囊产量降低。表明了球虫作为活载体疫苗具有可行性(Tangetal., 2018a；2018b)。

虽然活载体疫苗的研究尚处于试验研究阶段，还有一些瓶颈技术有待解决。但我们相信随着免疫学理论的不断丰富和先进技术的不断发展，疫苗载体的研究必将步入新的更高台阶，为人类和动物的健康做出更加突出贡献。

5 展望

近年来，随着公众对食品安全的重视和对“绿色食品”的推崇，疫苗是替代药物防控球虫病的重要举措。迄今为止，我们虽然在鸡球虫病疫苗的研究过程中(从活疫苗到基因工程疫苗)取得了令人鼓舞的成就，但还存在许多不足，如活卵囊疫苗虽然能提供完全保护，但存在制作工艺繁琐、容易扩散病原等问题。基因工程疫苗能诱发鸡体产生部分保护力但无法替代传统活疫苗。因此，未来需要进一步研究球虫虫体与宿主之间的相互作用，阐明鸡对球虫产生免疫应答的生理学和免疫学的机理，进而利用各种手段如基于细胞水平、全基因组范围筛查方法等鉴别出各种重要的保护性抗原，进而采用合适的抗原传递系统，我们有理由相信球虫基因工程疫苗最终能在鸡球虫病的免疫防治中发挥重要作用。