白术不同极性溶剂萃取物的抗氧化活性

曹清华， 杜 莹， 韦万丽， 周清娣， 廖莉玲

(1.贵州师范大学化学与材料科学学院，贵州贵阳 550001； 2.悉尼大学化学学院，澳大利亚悉尼 2006)

从中草药中提取抗氧化活性成分的研究已被国内外学者青睐，开发天然抗氧化剂已经成为研究的热点[1-2]。白术为菊科植物，其有效活性成分主要有白术内酯类、多糖和挥发油等[3]。目前，已有对白术黄酮、多糖抗氧化活性的研究[4-5]，但是鲜有对白术提取物化学成分含量和抗氧化活性的相关性报道。为了深入研究白术抗氧化活性成分，本研究采用清除2，2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基与测定总还原能力的方法，系统地评价白术粗提物不同极性溶剂萃取物的抗氧化活性，并探讨各萃取物的抗氧化能力及其与总多酚、总黄酮、总多糖含量之间的相关性，以期为白术抗氧化活性物质的进一步研究及白术的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白术，由贵州同济药业有限公司提供；芸香苷标准品，分析纯，购自贵州迪大科技有限责任公司；二苯基苦味酰基苯肼，分析纯，购自东京化成株式会社；没食子酸标准品，分析纯，购自天津市科密欧化学试剂开发中心；ABTS，分析纯，购自上海源叶生物有限公司；其余试剂均为分析纯。

分光光度计(L5s型，上海仪电分析仪器有限公司)；旋转蒸发仪(RE-52型，上海亚荣生化仪器厂)；电子天平(A200S型，德国)。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的制备 将白术粉碎后过40目筛，称取3 000 g白术粉末，用87%甲醇按料液比1 g ∶30 mL混匀，于62 ℃水浴提取2次，每次1.5 h，合并2次提取液，抽滤，于55 ℃真空减压浓缩至粉末状，得到粗品。取一定量粗品，用蒸馏水溶解，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，萃取3次，旋干各相溶液，分别得到石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相样品，按照式(1)计算得率：

C=m1/m2×100%。

(1)

式中：C为得率，%；m1为旋干后各部分的样品质量，g；m2为起始加入的白术样品质量，g。

1.2.2 总多酚含量的测定 参照文献[6]，以没食子酸为标准品，精确配制浓度为0.05 mg/mL的标准溶液，分别取1、2、3、4、5 mL标准溶液，依次加入2 mL FC试剂(即Folin-Ciocalteu试剂)、7.5 mL 15%碳酸钠溶液，定容到25 mL容量瓶中，反应时间为50 min，反应温度为35 ℃，在最大吸收波长770 nm下测定标准系列的吸光度。在同样条件下测定不同样品的吸光度，平行测定3次，代入回归方程，计算白术各溶剂萃取物样品的总多酚含量。

1.2.3 总黄酮含量的测定 总黄酮含量的测定采用 NaNO2-Al(NO3)3比色法[7]，以芸香苷为标准品，精确配制浓度为0.2 mg/mL的标准品溶液，等梯度取不同体积的溶液于 25 mL 容量瓶中，加入1 mL 5%亚硝酸钠，反应6 min后加入1 mL 10%硝酸铝溶液，静置6 min后再加入4.3%氢氧化钠溶液，定容，摇匀后静置20 min，在515 nm处测定标准系列的吸光度。在同样条件下测定不同溶剂萃取物样品的吸光度，平行测定3次，代入相应的回归方程，计算白术各溶剂萃取物样品的总黄酮含量。

1.2.4 总多糖含量测定 采用硫酸苯酚法[8]，以葡萄糖为标准品，精确配制浓度为0.2 mg/mL的标准溶液，等梯度取不同体积的标准溶液于10 mL具塞试管中，加入1 mL 5%苯酚溶液，再迅速加入5 mL浓硫酸，于沸水中反应30 min，冷却后在490 nm处测定标准系列的吸光度，在此条件下测定不同溶剂萃取物样品的吸光度，平行测定3次，代入回归方程，计算白术各溶剂萃取物样品的总多糖含量。

1.2.5 抗氧化能力测定 (1)清除DPPH自由基能力的测定。测定方法参考文献[9]，并作适当修改：取一定质量的样品，用80%甲醇溶解，配制成不同浓度的样液，分别向10 mL容量瓶中加入2 mL不同浓度的样液，再加入5 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，最后用80%甲醇定容到10 mL。摇匀后避光反应30 min，在517 nm波长下测定吸光度。平行测定3次，以维生素C作为阳性对照，按式(2)计算清除率，并计算清除DPPH自由基的IC50。

R=[1-(D517 nm(a)-D517 nm(a))/D517nm(c)]×100%。

(2)

式中：R为自由基清除率，%；D517 nm(a)为待测液的吸光度；D517 nm(b)为不加自由基的吸光度；D517 nm(c)为不加样液的吸光度。

(2)清除ABTS自由基的测定。测定方法参考文献[10]，并作适当修改：将样品配制成浓度为0.2 mg/mL的样液，分别取1、2、3、4、5 mL到10 mL容量瓶中，加入5 mL 0.2 mmol/L ABTS溶液，用无水乙醇定容到10 mL，室温下反应15 min后，在733 nm处测吸光度，平行测定3次，以维生素C作为阳性对照，清除率按式(2)计算，并求出清除ABTS自由基的IC50。

(3)总还原能力测定。测定方法参考文献[11]，并作适当修改：取1 mL样液，加入1 mL 磷酸缓冲盐溶液(即PBS，浓度为0.1 mol/L，pH值=6.8)、1 mL 1%六氰合铁酸钾溶液混匀，于50 ℃水浴30 min。冷却后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，混匀后在6 000 r/min下离心10 min，取2 mL上清液，加 3 mL 蒸馏水和1 mL 0.1%氯化铁溶液，静置10 min后，在700 nm处测定其吸光度，平行测定3次(吸光度越大，说明样品的总还原能力越强)。

1.2.6 相关性分析 采用Excel 2007处理数据并作图，通过SPSS 20.0软件对清除ABTS自由基、DPPH自由基、总还原能力与总多酚、总黄酮、总多糖含量进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 总黄酮、总多酚和总多糖含量的标准曲线

以吸光度对浓度作图，得出总多酚含量的回归方程为y=115.4x+0.030 4，r2=0.999 6，式中：y为D770 nm；x为多酚含量(mg/mL)。总黄酮的回归方程为y=11.363x+0.001 9，r2=0.999 9，式中：y为D515 nm；x为总黄酮含量(mg/mL)。总多糖含量的回归方程为y=0.012 8x+0.038 7，r2=0.999 6，式中：y为D490 nm；x为多糖浓度(mg/mL)。

2.2 白术不同极性溶剂萃取物的总黄酮、总多酚和总多糖含量

由表1可知，不同极性溶剂萃取的得率以水相最高，为(86.53±1.66)%，说明白术粗提取物中水溶性物质比较多，其次是正丁醇相，得率为(6.25±0.21)%，石油醚相的得率最低，为(1.14±0.11)%，表明白术粗提取物中极性较小的物质比较少。各分段部位中乙酸乙酯相中的总多酚含量最高，为(37.54±0.51)%，其次是正丁醇相、三氯甲烷相，总多酚含量分别是(17.64±0.56)%、(13.42±0.88)%，表明白术的粗提取物中多酚类物质属于中等极性的较多。各分段部位中总黄酮含量以乙酸乙酯相中最高，为(30.53±0.92)%，正丁醇相、三氯甲烷相中的总黄酮含量相差不大，分别为(18.83±0.02)%、(18.14±0.61)%，水相中总黄酮含量最低，为(4.22±0.79)%，表明白术的粗提取物中的黄酮类物质属于中等极性的较多，在极性大的溶剂中黄酮类物质含量较低。在各分段部位中，水相中的总多糖含量最高，为(22.58±0.34)%，石油醚相中总多糖含量最低，为(1.31±0.13)%。

表1 白术不同极性溶剂萃取物中的总黄酮、总多糖、总多酚含量及得率

2.3 白术不同极性溶剂萃取物的抗氧化活性

2.3.1 清除ABTS自由基能力 由表2、图1可以看出，白术粗提取物中不同极性溶剂萃取物清除ABTS自由基的效果最佳的是乙酸乙酯相，IC50为(0.021±0.003)mg/mL，浓度较小时，随着浓度提高，清除率迅速增加，当浓度达到0.06 mg/mL时，清除能力就趋于平缓，清除率超过80%，比维生素C清除能力略低。此外，正丁醇相清除ABTS自由基能力也比较好，IC50为(0.034±0.005)mg/mL，当含量大于0.08 mg/mL时，清除能力变化不大。三氯甲烷相、石油醚相和水相清除ABTS自由基的能力均随着浓度的增加而增加，IC50分别为(0.048±0.012)、(0.061±0.004)、(0.068±0.006)mg/mL，在相同浓度下，乙酸乙酯相、正丁醇相、三氯甲烷相、石油醚相、水相的清除能力依次减弱。

表2 白术不同极性溶剂萃取物的IC50值

2.3.2 清除DPPH自由基能力 由表2、图2可以看出，白术不同极性溶剂萃取物清除DPPH能力最强的是乙酸乙酯相，IC50为(0.031±0.005)mg/mL，当浓度达到0.08 mg/mL时，清除DPPH自由基的能力与维生素C的清除能力大致相同。在低浓度下，正丁醇相、三氯甲烷相清除DPPH的能力相差不大，IC50也比较接近，分别为(0.040±0.002)、(0.042±0.001)mg/mL；在高浓度下，正丁醇相的清除效果明显高于三氯甲烷相。石油醚相、水相清除DPPH自由基的能力相对较弱，随着浓度的增大，其清除效果增强。三氯甲烷相、水相、石油醚相清除DPPH自由基的差异较小，出现这种结果的原因可能是同一种多酚类物质对不同自由基的清除能力有差异，这与李伟等的报道[12-13]一致。

2.3.3 总还原能力 由图3可知，白术不同溶剂萃取物总还原能力最好的是乙酸乙酯相，比其他相要好很多，当浓度达到0.10 mg/mL时，与维生素C的总还原能力接近。当浓度为 0.02 mg/mL 时，三氯甲烷相、水相、正丁醇相、石油醚相的总还原能力基本一致，随着浓度增加，正丁醇相、三氯甲烷相的总还原能力的增加幅度明显大于石油醚相、水相，总还原能力排序依次是维生素C>乙酸乙酯相>正丁醇相>三氯甲烷相>石油醚相>水相。

2.4 总多酚、总黄酮、总多糖含量与抗氧化活性的相关性

由表3可知，清除DPPH自由基与清除ABTS自由基IC50、清除DPPH自由基IC50与总还原能力、清除ABTS自由基IC50与总还原能力测试方法之间的相关系数分别为0.929、-0.871、-0.899，清除ABTS自由基IC50与清除DPPH自由基IC50、总还原能力呈显著相关(P<0.05)。总多酚含量与清除ABTS自由基IC50呈显著负相关(r=-0.901，P<0.05)，即总多酚含量越高，IC50越小，清除ABTS自由基能力较强，总多酚含量与清除DPPH自由基IC50呈中等相关(r=-0.870)，总多酚含量与总还原能力呈极显著正相关(r=1.000，P<0.01)，即总多酚含量越高，总还原能力越强。总黄酮含量与清除ABTS自由基的IC50呈显著负相关(r=-0.912，P<0.05)，总黄酮含量与清除DPPH自由基的IC50呈极显著负相关(r=-0.976，P<0.01)，总黄酮含量与总还原能力呈显著正相关(r=0.913，P<0.05)。总多糖含量与清除ABTS自由基的IC50呈中等正相关(r=0.836)，总多糖含量与清除DPPH自由基的IC50呈显著正相关(r=0.913，P<0.05)，即总多糖含量越高，IC50越大，清除ABTS自由基、DPPH自由基的能力越小，总多糖含量与总还原能力呈负相关(r=-0.676)。

表3 总多酚含量、总黄酮含量、总多糖含量、清除ABTS IC50、清除DPPH IC50、总还原能力间的相关性

综上所述，白术不同极性溶剂萃取物中的总多酚、总黄酮含量排序为乙酸乙酯相>正丁醇相>三氯甲烷相>石油醚相>水相，说明白术多酚、黄酮主要为中等极性物质，各萃取物中总多糖含量排序为水相>正丁醇相>乙酸乙酯相>三氯甲烷相>石油醚相。各萃取物清除ABTS自由基、DPPH自由基的能力及总还原能力的排序均为维生素C>乙酸乙酯相>正丁醇相>三氯甲烷相>石油醚相>水相，表明各极性部位的抗氧化能力排序为乙酸乙酯相>正丁醇>三氯甲烷>石油醚>水相，与样品中总黄酮、总多酚的含量排序相同，存在显著相关性，而总多糖含量越高，样品清除ABTS、DPPH自由基的能力越弱，说明黄酮类、多酚类可能是白术的主要抗氧化物质，多糖不是白术的主要抗氧化物质。

3 结论

本研究应用清除DPPH自由基、ABTS自由基法与总还原力法对白术不同极性溶剂萃取物的抗氧化能力进行了系统评价。结果表明，白术不同极性溶剂萃取物清除ABTS自由基、DPPH自由基能力与总还原能力的排序相同。乙酸乙酯相清除ABTS自由基、DPPH自由基的效果最好，IC50分别为(0.021±0.003)、(0.031±0.005)mg/mL，总还原能力也最强，同时，乙酸乙酯相中总多酚、总黄酮含量最高，分别是(37.54±0.51)%、(30.53±0.92)%。其他萃取物的总黄酮、总多酚含量与抗氧化活性强弱排序一致，总多酚、总黄酮含量与清除自由基能力呈负相关，与总还原能力呈显著或极显著正相关，而总多糖含量与清除自由基能力呈正相关，提取物中黄酮类、多酚类可能是主要抗氧化物质，可以通过进一步的分离提纯活性较好、多酚黄酮含量高的乙酸乙酯相、正丁醇相，得到抗氧化活性物质。

本研究综合评价了白术提物不同极性溶剂萃取物的抗氧化活性，并探讨了抗氧化能力与总多酚、总黄酮和多糖含量之间的相关关系，可以为白术抗氧化活性物质的分离研究提供科学依据。