大蒜素对猪卵巢卵泡颗粒细胞凋亡的影响

丁 威， 汤 静， 周燕芬， 邢 军

(1.江苏农林职业技术学院，江苏句容 212400； 2.江苏省农业科学院，江苏南京 210014)

卵泡闭锁是卵巢卵泡发育过程中一种正常的生理现象，该现象受多种因素影响和调控，在哺乳动物的一生中，最终只有少量卵泡发育为优势卵泡并排卵，而90%以上的卵泡将发生闭锁[1]。营养、环境或毒理方面的因素可能会造成卵泡的大量闭锁，从而影响动物生产。在猪卵巢卵泡闭锁过程中，颗粒细胞层逐渐脱落，未脱落的颗粒细胞比较饱满，在高倍镜下可清楚地见到凋亡的颗粒细胞核内形成的凋亡小体。虽然从形态特征上能够观测到卵泡闭锁的变化，但有关猪卵泡闭锁的机制及其挽救措施仍有待研究。

大蒜素为天然存在于百合科植物大蒜(AlliumsativumL.)鳞茎中的一种具有抗癌活性的成分，为三硫代烯丙醚类化合物，农业上用作杀虫剂、杀菌剂[2-4]，也用于饲料生产、食品加工及药品生产等方面。相关研究表明，大蒜素作为一种具有多种功能的饲料添加剂，既可以通过改善动物机体内各组织器官功能，强化胃肠道蠕动与消化酶的代谢，增加畜禽及鱼类的采食，提高畜禽对饲料的消化利用，从而提高畜禽的生产性能[5]，又可以增强畜禽的免疫机能，从而预防多种疾病。但有关大蒜素对猪繁殖尤其是卵泡闭锁的影响研究较少。

本试验应用大蒜素对体外培养的猪卵巢颗粒细胞进行处理，通过检测处理后颗粒细胞的凋亡情况及类固醇激素合成水平等，揭示大蒜素对猪卵巢卵泡颗粒细胞发育和功能的调控机理。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

从江苏省南京市某生猪屠宰加工厂采集健康的猪卵巢作为试验材料。将采集后的卵巢迅速放入装有含青霉素、链霉素的37 ℃生理盐水的保温杯中，于2 h内运回实验室。从某饲养场采集梅山猪的卵巢组织，放于4%多聚甲醛中固定 36～48 h，用于免疫组织化学染色试验。

大蒜素购于Sigma公司；DMEM/F-12细胞培养液、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、青霉素、链霉素购于Life Technologies公司；胎牛血清购自Gibco公司；细胞增殖试剂盒、免疫荧光试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG、HRP标记的驴抗羊IgG购自上海碧云天生物技术有限公司；雌二醇和孕酮放射免疫(RIA)检测试剂盒购自北京北方生物技术研究所；苏木素染料购自南京建成生物工程研究所；链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)试剂盒、3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、Caspase-3活性检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 卵巢组织的免疫组织化学染色 参照丁威等的方法[6]对卵巢组织的免疫组织进行化学染色。脱蜡止水：二甲苯Ⅰ 7 min→二甲苯Ⅱ 7 min→100%乙醇Ⅰ 5 min→100%乙醇Ⅱ 5 min→90%乙醇5 min→70%乙醇2 min→蒸馏水5 min；灭活内源酶：用3%甲醇-H2O2处理15 min→蒸馏水5 min；抗原热修复：柠檬酸三钠(pH值=6.0)100 ℃ 10 min→PBS洗涤3次，每次3 min；加一抗：10%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，简称BSA)室温封闭30 min→一抗加入后，须要在室温条件下过夜，阴性对照可用1% BSA代替(cleaved-Caspase3抗体稀释浓度为1 ∶200)PBS洗涤3次，每次3 min；SABC(strept avidin-biotin complex)反应：二抗加入后，须要在室温条件下30 min→PBS洗涤3次，每次3 min→加SABC，室温15 min→PBS洗涤3次，每次3 min；显色：0.05% DAB+0.01% H2O2，显色2～10 min→水冲洗5 min→苏木素复染→水冲洗5 min；脱水透明：50%乙醇2 min→70%乙醇2 min→90%乙醇2 min→100%乙醇Ⅰ 2 min→100%乙醇Ⅱ 2 min→二甲苯Ⅰ 4 min→二甲苯Ⅱ 4 min；封片，用光学显微镜观察并拍照，切片中棕褐色代表阳性表达。

1.2.2 细胞培养和处理 参照宋丹等的方法[7]对细胞进行培养和处理。在实验室中将从屠宰场采集来的卵巢用37 ℃生理盐水清洗3次，然后用10 mL注射器从卵巢表面选择直径为3～5 mm的卵泡抽取卵泡液，放入离心管静置10～15 min，1 500 r/min离心2 min，PBS洗3次后，用血细胞计数板进行计数。将颗粒细胞放入含10%胎牛血清、20 ng/mL促卵泡素(FSH)、100 mg/L链霉素和100 IU/mL青霉素的基础培养液6孔细胞培养板中，于5% CO2和37 ℃的培养箱中培养24 h，然后将颗粒细胞分成4组，第1组继续用基础培养液培养作为对照，第2组为添加H2O2(100 μmol/L)处理、第3组为添加大蒜素(50 μmol/mL)处理、第4组为添加大蒜素(50 μmol/mL)+H2O2(100 μmol/L)处理，其中大蒜素固体溶解于PBS并添加到培养液中，终浓度为50 μmol/L。培养24 h后，收集培养液用于类固醇激素水平测定。

1.2.3 类固醇激素测定 采用酶联免疫法测定颗粒细胞培养液中的雌二醇(E2)和孕酮(P4)含量。E2和P4的灵敏度分别为<5 pg/mL和<0.2 ng/mL，批内变异系数小于10%，批间变异系数小于15%。

1.2.4 DAPI凋亡检测 用6孔板接种传代猪颗粒细胞以制作细胞爬片并进行相应处理。细胞在盖玻片上生长融合到90%左右时从孵箱中取出，用预温37 ℃ PBS洗3次，每次10 min，4%甲醛室温固定30 min，PBS洗3次，每次10 min，然后用0.2% Triton X-100透化30 min，加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)孵育 10 min，PBS清洗3次，每次10 min，最后在激光共聚焦显微镜观察并拍照。

1.2.5 细胞增殖活性检测 从对照、H2O2、大蒜素、大蒜素+H2O2等4组处理中分别取100 μL约2 000个颗粒细胞放入96孔板中，依据MTT试剂盒说明书，每孔加入10 μL MTT溶液，在培养箱内孵育4 h，然后每孔再加入100 μL Formanzan溶解液继续孵育4 h，直到在普通光学显微镜下能够观测到Formazan全部溶解，然后早570 nm处的测定溶液吸光值。

1.3 数据分析

用Excel 2010对原始数据进行整理，然后用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，差异显著性比较采用Turkey检验法，所有数据均用(平均值±标准差)表示，至少重复4次。

2 结果与分析

2.1 Cleaved Caspase3蛋白在猪卵巢卵泡中表达的定位

魏全伟研究表明，Caspase3在由颗粒细胞凋亡引起卵泡闭锁的过程中的表达存在显著升高现象。为了进一步研究Caspase3的激活(Cleaved Caspase3)在猪卵巢卵泡壁退化过程的作用，选取正在闭锁的卵泡(即颗粒细胞正在凋亡和脱落的卵泡)进行研究。免疫组织化学染色结果表明，随着卵泡的闭锁，颗粒细胞凋亡并脱落在卵泡腔内，颗粒细胞凋亡伴随着染色质的浓缩。颗粒细胞的凋亡伴随着Caspase3的激活(图1-B、图1-E)，而在健康的卵泡中几乎不存在Caspase3的激活(图1-A、图1-D)。

2.2 颗粒细胞培养液中E2和P4激素水平变化

由图2可知，氧化应激组(过氧化氢处理)中的E2浓度显著低于对照组、50 μmol/L大蒜素处理组及50 μmol/L大蒜素和过氧化氢共同处理组(P<0.05)；而氧化应激组P4浓度显著高于对照组、50 μmol/L大蒜素处理组及50 μmol/L大蒜素和过氧化氢共同处理组(P<0.05)。表明大蒜素可以提高颗粒细胞在氧化应激状态下雌二醇分泌能力，并抑制颗粒细胞黄体化。雌激素和孕激素可以作为检测细胞状态的指标，结果表明，大蒜素处理下细胞状态相对更好。

2.3 猪卵巢颗粒细胞的凋亡情况

颗粒细胞培养24 h后，将制作好的细胞爬片进行DAPI染色，用激光共聚焦显微镜细胞凋亡情况。结果(图3)表明，与对照组相比，氧化应激组大量细胞发生形态学变化，而大蒜素处理组有效缓解了上述变化。细胞凋亡的典型特征包括细胞皱缩、染色质固缩、染色质新月体形成、DNA片段化和凋亡小体形成等。

2.4 猪原代颗粒细胞的增殖情况

由图4可知，与对照组相比，氧化应激组颗粒细胞增殖活性显著降低，而添加大蒜素与H2O2协同处理以后能够显著增加细胞增殖活性。该结果与凋亡检测结果相一致。

3 讨论

目前普遍的学术观点认为，卵泡闭锁主要是由卵巢卵泡颗粒细胞凋亡引起的[8]。因此，颗粒细胞凋亡的潜在机制可能是研究卵泡闭锁的重要突破点和关键点。目前有关大蒜素抑菌作用的研究较多，相关研究认为，大蒜素可激活单核细胞的分泌水平，促使溶菌酶大量释放，溶菌酶能水解细菌细胞壁中的粘多糖，使致病菌细胞破裂死亡，进而增强机体的非特异性免疫功能[9]。然而，有关大蒜素在颗粒细胞凋亡方面的研究较少。

免疫组织化学染色试验结果表明，卵泡闭锁过程中颗粒细胞的凋亡激活了Caspase3；而前期研究认为，Caspase3能够进一步解离PARP-1，而PARP-1的解离参与卵泡闭锁过程[10]。本研究发现，大蒜素能够作用于卵巢颗粒细胞，并缓解H2O2造成的颗粒细胞凋亡。

在卵泡发育过程中，颗粒细胞不断增殖使得卵泡不断生长，并最终排卵[11-13]。颗粒细胞是卵巢中合成和分泌雌激素、孕酮等激素的主要功能细胞。多种哺乳动物的卵巢生长和卵泡发育均与卵巢的雌激素、孕激素分泌水平相关[14-16]。本研究发现，大蒜素可以改善氧化应激状态下卵巢颗粒细胞的内分泌功能，表明大蒜素可用于猪生产，以提高猪抗应激水平和调节卵巢发育。

本研究结果还表明，氧化应激状态下，颗粒细胞的增殖受到抑制，而大蒜素能够在一定程度上提高颗粒细胞的增殖活性。该结果进一步说明大蒜素对颗粒细胞内分泌功能具有改善作用，为猪繁殖的营养调控提供参考。此外，应用体外猪卵巢颗粒细胞氧化应激模型，本研究结果进一步说明大蒜素在抑制颗粒细胞凋亡过程中可能发挥着某种重要的作用，可为大蒜素在猪育种及生产过程提供有价值的参考依据。而相关作用机制仍有待进一步研究阐明。