柳叶栒子组培快繁体系的建立

马媛春， 张粉粉， 程宗明

(南京农业大学园艺学院，江苏南京 210095)

柳叶栒子(Cotoneastersalicifolius)为栒子属植物，多生于山地沟边杂林中、海拔1 800～3 000 m处，一般分布于我国的湖北、湖南、四川、贵州等地[1]。柳叶栒子的叶片呈革质而油亮，果实红而累累，不但可以作为一种优美的园林植物来应用，而且柳叶栒子是一味珍贵的中药材，对于治疗咳嗽、除风热有很好的疗效。我国对栒子属植物的研究和开发利用起步较晚。过去柳叶栒子主要依靠播种繁殖，不仅繁殖速度慢，繁殖的量也很少，柳叶栒子并没有发挥其应有的园林及药用价值，关于柳叶栒子的研究更是少之又少，几乎没有。而如今，随着组织培养[2]和细胞培养[3]等新技术的产生，使得柳叶栒子的大量扩繁有了可能，通过组织培养技术将可以在短时间内培育出大量柳叶栒子幼苗。除柳叶栒子外，我国还有57种栒子植物，约占全世界栒子植物数量的2/3，但是全国各地对于栒子引种栽培的报道很少[4-6]，关于组培快繁成功的案例更是少之又少。所以通过建立柳叶栒子组培快繁体系，对栒子属植物的组培快繁体系的研究也有帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

以柳叶栒子的实生苗为试验材料(种子来自加拿大的城市公园，于2016年3月份播种于南京农业大学生科楼7楼果树生物学实验室育苗室)，进行消毒灭菌后，接种培养。

1.2 方法

1.2.1 外植体灭菌 选取长势较好的实生苗，剪切成4 cm左右的带芽茎段作为试验材料，放入容器中，在自来水下冲洗2 h，后移至超净工作台内，用70%乙醇浸泡外植体30 s后用无菌水冲洗3次，然后用浓度为4%的次氯酸钠分别处理3、4、5、6 min，再用无菌滤纸吸干茎段表面的水分[7]，将其切成 1 cm 左右的带芽茎段，最好可以保留1～2张小叶片，再接种[8]。每个处理接种20瓶，每瓶接种1个外植体，重复3次，30 d后统计成活率。

1.2.2 腋芽诱导培养 将无菌茎段接种到腋芽诱导培养基上，首先为了确定腋芽在哪种基本培养基上诱导的效果更好，选取MS、1/2MS、1/2WPM 3种基本培养基[9]，在3种基本培养基内添加浓度相同的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)[10]进行预试验，20 d后发现，腋芽在MS培养基上诱导的效果最好，因此在初代培养时选择MS作为基本培养基，另外发现，在培养基中加入抗菌物质1.2 mg/L PPM(plant preservative mixture，植物组培抗菌剂)可以大大降低污染率[11-12]。由于初代培养的目的是为了诱导新芽，因此加入的细胞分裂素的浓度应高一些，生长素的浓度应该低一些[13-14]，本试验选取的细胞分裂素为6-BA，浓度为0.5～3.0 mg/L，生长素为NAA(即α-萘乙酸，在预试验中，得出最适宜的NAA浓度为 0.02 mg/L)，共组成4种培养基：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+1.2 mg/L PPM、MS+0.8 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+1.2 mg/L PPM、MS+1.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+1.2 mg/L PPM、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+1.2 mg/L PPM。在每种培养基接种20瓶，每瓶接种1个外植体，先放置在暗环境[15-16]中培养1周，再移至光环境下培养，来减轻褐化现象[17-18]，重复3次，30 d后统计腋芽萌发率。

1.2.3 丛生芽增殖培养 将初代培养30 d的组培苗新生芽剪下，切成1 cm左右的带芽茎段，保留1～2张小叶片，转入继代培养基进行增殖培养。首先经过预试验，确定继代培养的最佳基本培养基也是MS培养基，并且发现继代培养时不适宜加入NAA、IBA，只适宜加入6-BA[19-21]，浓度为0.5～2.0 mg/L，共组成4种培养基：MS+0.5 mg/L 6-BA、MS+1.0 mg/L 6-BA、MS+1.5 mg/L 6-BA、MS+2.0 mg/L 6-BA，每种培养基接种20瓶，每瓶接种1个外植体，重复3次，30 d后统计增殖率。

1.2.4 壮苗培养 由于前面阶段所获得的柳叶栒子无菌苗都比较矮小，不适宜直接用于诱导生根，需要经过壮苗培养，使苗长得强壮一些再进行生根培养。

1.2.5 生根培养 这个阶段主要是诱导组培苗生出不定根[22-23]。在壮苗培养的过程中发现，组培苗在1/2MS、F培养基内有生根现象，因此选择F、1/2MS作为生根的基本培养基。另外在壮苗培养中还发现，生长素浓度过高的培养基中几乎没有生根现象[14]，因此在生根培养基中选择加入低浓度的NAA，浓度为0～0.1 mg/L，IBA浓度为0～0.3 mg/L，共组成8种培养基：1/2MS+0.05 mg/L NAA、1/2MS+0.1 mg/L IBA、1/2MS+0.1 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA、1/2MS+0.3 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA、F+0.05 mg/L NAA、F+0.1 mg/L IBA、F+0.1 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA、F+0.3 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA。每种培养基接种20瓶，每瓶接种1个外植体，重复3次，30 d后统计生根率。

1.2.6 组培苗的驯化移栽

1.2.6.1 组培苗的驯化 将生根健壮的组培苗从培养室移出来，放入温室内，共6种炼苗方式：闭瓶炼苗0 d，开瓶炼苗0 d；闭瓶炼苗0 d，开瓶炼苗7 d；闭瓶炼苗7 d，开瓶炼苗0 d；闭瓶炼苗4 d，开瓶炼苗3 d；闭瓶炼苗7 d，开瓶炼苗4 d；闭瓶炼苗7 d，开瓶炼苗7 d。每种方式处理20瓶，每瓶1个外植体，重复3次。为了防止在开瓶炼苗期间湿度降低造成小苗干枯，每天要定时用纯净水喷洒小苗1次。

1.2.6.2 组培苗的驯化 在经过一段时间的炼苗处理之后，将长势依旧茁壮的小苗从瓶中移出来，在移出来的过程中要用镊子慢慢地小心地夹取小苗，以免小苗受到破坏。然后再将小苗放在自来水下，将残留的培养基物质冲洗干净。另外还要剪去小苗多余的叶片，以降低小苗的蒸腾作用，冲洗干净后把小苗移入蛭石、泥炭土、珍珠岩体积比=2 ∶1 ∶1的基质中，移栽之前应对基质进行灭菌，本试验采用的方法是将基质放入高压蒸汽灭菌锅内灭菌3 h，再冷却1 d，待气味散去之后再进行移栽。

2 结果与分析

2.1 外植体灭菌

污染率随着消毒时间的增加而减少，但是褐化率却几乎随着消毒时间的增加而升高，当用4%次氯酸钠消毒5 min时，组培苗的成活率最高，因此先用浓度为70%的乙醇对外植体消毒30 s，再用浓度为4%的次氯酸钠消毒5 min是最适宜的灭菌方式。

2.2 腋芽诱导

6-BA对腋芽诱导有很大的影响，结果见表1。从生长情况来看，经过30 d初代培养后，各培养基内的生长情况有很大区别，当6-BA浓度为2.0 mg/L时，丛生芽几乎纠结成团，变畸形，颜色有些呈深褐色，详见图1。当6-BA浓度为1.5 mg/L时，丛生芽比较细弱，还有些玻璃化，颜色较淡。当 6-BA 浓度为0.8 mg/L时，丛生芽长势较好，颜色正常，详见图2。从各培养基内丛生芽的数量来看，当6-BA浓度为 0.8 mg/L 时，丛生芽数量最多，平均有12.33个，诱导率也最高，为61.65%；不添加6-BA的MS培养基中一直都没有产生丛生芽；而当6-BA浓度为2.0 mg/L时，丛生芽的数量平均只有3.33个，诱导率仅为16.65%。另外，各培养基内丛生芽的数量随着时间的变化趋势也不尽相同，最早产生丛生芽的培养基是MS+0.8 mg/L 6-BA，且丛生芽数量一直在增加，增加得也最快；最晚产生丛生芽的培养基是MS+2.0 mg/L 6-BA，丛生芽的数量基本保持不变。综上可以得出，最适宜的腋芽诱导培养基是MS+0.8 mg/L 6-BA。

表1 不同浓度6-BA对腋芽诱导的影响

2.3 丛生芽增殖

经过30 d的继代培养后发现，培养基中添加的6-BA浓度不同，丛生芽增殖的结果也不同，详见表2。从丛生芽数量来看，随着6-BA浓度的逐渐升高，丛生芽的数量也在一定范围内逐渐增多，但当6-BA浓度过高时，即MS+2.0 mg/L 6-BA培养基中丛生芽的数量反而比培养基MS+1.5 mg/L 6-BA中的少很多。从组培苗的平均生长量来看，在MS+1.0 mg/L 6-BA培养基中，丛生芽长得最快也最健壮，详见图3；在培养基 MS+2.0 mg/L 6-BA上，丛生芽长得很慢，有畸形苗，长势最差，详见图4。从整体上来看，最适宜的继代增殖培养基是MS+1.0 mg/L 6-BA。另外，在继代培养时还发现，继代次数对丛生芽增殖有一定的影响，在对柳叶栒子组培苗进行了7次继代后发现，丛生芽增殖能力最强的是第3、

4次继代，增殖倍数分别为8.95、9.25，增殖能力最弱的是第7次继代，增殖倍数仅为3.90，第4次继代的增殖倍数比第7次的高1倍以上。前4次继代丛生芽的增殖能力都很强，而在第5次继代之后，增殖能力逐渐减弱。因此可以看出，继代的次数不一定是越多越好，随着继代次数的增加，组培苗体内的激素也会慢慢积累，从而抑制组培苗增殖。因此在平时继代时，要对定期继代的组培苗更换培养基，或者及时进行再次初代培养。

表2 不同浓度6-BA对丛生芽增殖的影响

2.4 生根培养

由表3可以看出，IBA、NAA及基本培养基的类型都对组培苗的生根有影响。当基本培养基为F时，NAA对生根的影响大于IBA，当NAA浓度为0.05 mg/L时，根系长势最好。当以1/2MS作为基本培养基时，IBA、NAA对生根的影响都很大。只考虑IBA的影响时，当IBA浓度为0.1 mg/L时，生根较早；只考虑NAA浓度的影响时，当NAA浓度为0.1 mg/L时，根系最粗壮。综合3个因素来看，生根率较高、根的长势较好的培养基组合是F+0.05 mg/L NAA。

表3 不同培养基组合对组培苗生根的影响

2.5 炼苗移栽

经过炼苗的5个试验组的成活率都远远高于空白对照组第1组。在本研究的6种炼苗方式中，只闭瓶炼苗或只有开瓶炼苗的成活率都低于既有闭瓶炼苗过程又有开瓶炼苗过程处理方式的成活率，而其中成活率最高的是先闭瓶炼苗 7 d，再开瓶炼苗4 d处理，成活率为72.58%。由此可以得出以下结论：(1)组培苗在移栽前需要进行炼苗；(2)在炼苗时要注意对时间的控制；(3)炼苗需要开瓶与闭瓶相结合才能取得理想的效果；(4)对柳叶栒子组培苗比较适合的炼苗方式是先将其闭瓶炼苗7 d，再将其开瓶炼苗4 d。

在移栽时发现，当基质中只有泥炭土与只有泥炭土与蛭石时，基质的透气性差，小苗根部容易被淹，成活率极低；当基质中只有蛭石与珍珠岩时，基质的透气性虽好，但几乎不保水，导致小苗逐渐干枯，缺水症状严重，成活率也不高；当基质中泥炭土、蛭石、珍珠岩三者都有时，成活率较高，详见图5，但是如果三者比例不当，小苗的长势也不是很好。最后，筛选出最适宜柳叶栒子组培苗移栽的基质是蛭石、泥炭土、珍珠岩体积比为2 ∶1 ∶1。

3 结论与讨论

在柳叶栒子腋芽诱导时期，适宜的培养基为MS+0.8 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+1.2 mg/L PPM；在丛生芽增殖时期，最适宜柳叶栒子继代增殖的培养基是MS+1.0 mg/L 6-BA；在生根培养时，最适宜的生根培养基是F+0.05 mg/L NAA，最佳炼苗方式是先闭瓶炼苗7 d，再开瓶炼苗4 d；最适宜的移栽基质是蛭石、泥炭土、珍珠岩体积比=2 ∶1 ∶1，移栽成活率高达72%以上。在选择外植体时，最初用的是柳叶栒子的一年生茎段，最后因为污染非常严重而失败，后来改用柳叶栒子实生苗作为外植体，进行灭菌后成活率较高。植物的不同部位所含菌量不同，采集外植体时要加以仔细选择。继代次数对于柳叶栒子丛生芽增殖有影响，不同植物受继代次数的影响也不同。东方百合在进行继代培养时，继代3次后小苗的分化能力逐渐变弱，长势也逐渐变差[24]。本研究中，在进行生根之前先对组培苗进行壮苗培养，在这个过程中只加入植物激素NAA，除了植物激素外，还可以考虑加入一些其他天然添加物，如香蕉泥、番茄泥等天然添加物，以及活性炭和马铃薯泥、椰子汁等物质，这些天然添加物价格低廉而且便于获取，效果会很明显，在以后的壮苗培养时可以适量加入。

通过建立柳叶栒子组培快繁体系来繁殖柳叶栒子，生产周期短，仅为4个月，而且繁殖速度非常快，生产出来的苗特别多，性状也一致，可以实现柳叶栒子的工厂化生产，使得柳叶栒子在不久的将来可以大规模应用于园林中，从而为中国的园林绿化增添一抹亮色。