高尔基体通过自噬调控成骨分化的研究进展

孟许亚，布文奂,2，刘 杰,2，王 璐,2，于 烁，孙茂蕾,2，孙宏晨

(1.吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室，吉林 长春 130021；2.吉林大学口腔医院病理科，吉林 长春 130021；3.吉林大学口腔医院VIP综合科，吉林 长春 130021)

骨类疾病是指骨的完整性和功能性遭到破坏，可由炎症、外伤、肿瘤、感染和先天性疾病等因素引起。自噬是指细胞内一些需降解的蛋白质和细胞器等胞浆成分被包裹，最终被运送至溶酶体降解的过程，在一定条件下自噬可以促进细胞成骨分化[1]。高尔基体最早发现于1898年，是一种重要的亚细胞结构，主要参与蛋白质和脂质的加工、分选、运输和定向分泌到质膜和溶酶体，并参与到自噬体的形成[2]。本文主要围绕成骨分化、自噬和高尔基体三者的关系进行简要综述。

1 自噬与成骨

出生后生物体骨组织的生长、发育、改建和修复主要依赖于成骨细胞和破骨细胞的功能协调，其中成骨细胞可以产生骨基质蛋白，通过矿化促进骨量的增加；破骨细胞则主要通过骨吸收引起骨量降低。研究[3]表明：自噬在成骨分化过程中发挥重要作用。

1.1 自噬相关的骨类疾病自噬作为近年来的研究热点，已被证明其发生与机体多种骨类疾病均存在密切联系。成骨不全症是由Ⅰ型胶原缺陷引起的骨发育障碍性疾病，又称脆骨病或脆骨-蓝巩膜-耳聋综合征，主要作用的靶细胞是成骨细胞祖细胞，α1-Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ alpha 1，COL1A1) 和α2-Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ alpha 2，COL1A2) 基因突变引起自噬增加[4]。多发性硫酸酯酶缺乏症可严重缩短轴向和垂直向骨骼，引起骨发育障碍和神经退行性疾病，并伴发自噬体的增多[5]。包涵体肌病、佩吉特病和额颞叶痴呆是由含缬氨酸蛋白质(valosin-containing protein，VCP)中的p97 / VCP基因突变引起的肌肉、脑和骨骼等多器官退化，可影响机体正常生理功能，同时伴发自噬流的减少[6-7]和自噬障碍。

1.2 自噬体相关基因和蛋白与成骨分化骨质疏松症作为一种常见的骨关节类疾病，主要由破骨细胞和小范围的成骨细胞功能异常引起，表现为骨矿化程度降低、骨结构紊乱和脆性增加，容易发生骨折。研究[4]表明：骨质疏松症的发生与多种自噬相关基因，如磷脂酰肌醇3激酶催化亚基3型(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3，PIK3C3)、自噬相关基因(autophagy related gene，ATG) 中的ATG7、ATG5、ATG12及腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的α2亚基基因(PRKAA2)、 Beclin1、GABA A型受体相关蛋白1(GABA type A receptor associated protein like 1，GABARAPL1)和干扰素α13(interferon alpha 13，IFNα13)的异常表达有关。受体蛋白Brca1(neighbor of Brca1 gene protein，Nbr1)在调节胚胎发育和出生后的骨骼重塑过程中发挥重要作用[8-9]。Nbr1可以与自噬相关蛋白p62靶向泛素化底物到自噬体途径[10]，并作为成骨细胞分化和骨发生的负向调节因子参与调节成骨细胞中的p38-丝裂源活化蛋白激酶(MAPK)依赖性的成骨细胞分化过程，其功能丧失可引起p62表达紊乱和p38-MAPK的过度激活[11]。此外，p62可以调节细胞外调节蛋白激酶(ERK)活性[12]，也可以与p38-MAPK相互作用调节其活性[13]。Nbr1和p62通过调节不同细胞中的信号通路，在骨重建的调控中发挥重要作用；在临床应用方面，通过识别并阻断Nbr1基因表达促进成骨细胞分化，增加骨量，从而达到治疗疾病的目的。

骨重建是一个连续的生理过程，需要从间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)中恒定地产生新的成骨细胞。 MSCs的成骨细胞分化需要足够的能量供应，而线粒体是主要的供能细胞器，因此成骨细胞分化可引起线粒体呼吸作用增强，活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平升高。转录因子FOXO3是已知的自噬调节因子，通过自噬消除过量的ROS，发挥抗氧化作用，调控ROS稳态，为MSCs提供重要的抗氧化防御机制，维持骨骼更新的平衡，确保产生新的成骨细胞，从而达到促进成骨细胞分化的目的[14]。

微小RNA(microRNA，miRNA)是小的非编码RNA，通过降解mRNA或抑制转录后翻译水平调节基因表达，在干细胞自我更新、分化和多能性中发挥重要作用。miRNA作为细胞分化中的关键调控因子已成为近年来广受关注的热点。成骨细胞分化实验[15]结果显示：分化旺盛的细胞中miRNA-211表达水平高，阻断这种miRNA的表达则成骨细胞的分化也明显受到抑制；增强其表达可诱导成骨细胞分化。另外，miRNA-211抑制剂可以抑制分化细胞中的自噬体相关基因Atg14 mRNA和蛋白表达；miRNA-211模拟物可导致Atg14 mRNA和蛋白质表达的增加。因此推测miRNA-211可引起成骨细胞样细胞中的Atg14表达上调，从而导致成骨细胞分化的增加。

研究[16]表明：自噬对诱导成骨细胞分化有重要作用，AMPK可以通过激活成骨细胞分化所必需的自噬而刺激成骨，自噬空泡可作为成骨细胞中的载体分泌磷灰石晶体，促进矿化，而自噬的缺乏会降低矿化能力。在体内实验中观察到：成骨细胞特异性自噬缺陷小鼠的骨小梁减少50%。成骨细胞中的自噬涉及矿化过程和骨稳态，自噬相关蛋白ATG7和Beclin1是成骨细胞矿化所必需的，原发性成骨细胞ATG5缺乏，使矿化能力降低并增加破骨细胞[17]。另外，在对MC3T3-E1细胞的研究[18]中，自噬的上调会导致其成熟和终末分化。以上研究均表明自噬是正常细胞成骨分化所必需的。

2 高尔基体与自噬

高尔基体是一种膜性囊泡结构复合体，又称扁平囊泡，其断面微曲呈弓形，通常有3～8个扁平囊泡平行排列，聚簇成堆，构成高尔基体的主体结构；其凸面朝向细胞核，称之为顺面或形成面，位于高尔基体囊泡形成面的小囊泡系来自粗面内质网的运输小泡，一方面完成内质网向高尔基体的物质转运，另一方面也使扁平囊泡的膜结构及其内含物得以不断地更新和补充；其凹面朝向细胞膜，称之为反面或成熟面。大囊泡也称作分泌泡，见于扁平囊泡成熟面，由扁平囊泡末端膨大、离断而形成。

真核生物细胞内物质的降解途径主要分为2种：一种是依赖于蛋白酶体的小分子降解；另一种是依赖于自噬的大分子降解，通过形成双层膜结构的自噬体，包裹要降解的物质，与溶酶体融合，并最终被酶解[19]。自噬作为真核细胞中广泛存在的降解和再循环系统，可由缺氧、营养缺乏、代谢、氧化和蛋白毒性应激等应激条件引起[20]。另外，研究[5，21]显示：自噬作为细胞内大分子物质降解的主要方式，不仅在生物体正常发育、肿瘤抑制、病原体抗性和衰老中发挥重要作用，而且在几种人类病理性疾病，如癌症、糖尿病、心肌病和神经退行性疾病(如阿尔茨海默病和帕金森病)等发生过程中也发挥重要作用。

2.1 高尔基体与自噬体的形成自噬体是一种双层膜结构的细胞器，随着近年来对自噬体的研究，对其有了更深刻和全面的认识。对自噬体相关蛋白在亚细胞结构定位的研究[22]显示：自噬体的形成与内质网、高尔基体、线粒体和细胞膜均有密切联系。部分内质网上无核糖体附着的结构，可自身折叠形成隔离膜，隔离膜不断延伸，最终闭合形成双层膜的囊状结构的自噬体，这种位于2个内质网膜之间的双层膜结构的隔离膜是自噬体形成的基础。研究[23]显示：细胞内的膜运输系统可能也在自噬体形成中发挥关键作用。存在于内质网和高尔基体之间的膜性结构ER-Golgi中间体(ER-Golgi intermediate compartment，ERGIC)，在一定条件(如饥饿)的刺激下，可以激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，促使Ⅱ型包膜蛋白(coat proteins Ⅱ，COPⅡ)从内质网分泌到ERGIC ，形成COPⅡ囊泡，作为LC3脂化的模板，是自噬发生的关键步骤。另外，ERGIC还可以促进早期自噬体的标记物自噬相关蛋白ATG14聚集，这是早期自噬体膜生成的关键一步，也是自噬体在体内生成所必需的[24]，而Ⅰ型包膜蛋白(coat proteins Ⅰ，COPⅠ)主要参与自噬体的延伸和成熟[25]。

存在于细胞内的保守的低聚高尔基体复合物(conserved oligomeric Golgi，COG)是一种异五聚体复合物，由8个亚基组成，分布在2个叶中。叶A含有COG2～4，叶B由COG5～8组成，COG1是连接2个叶的中央亚基。COG主要参与调节高尔基体转运和维持真核细胞中高尔基体结构的完整性，COG亚基定位于自噬体集合位点(phagophore assembly site，PAS)，通过与自噬体相关蛋白相互作用参与自噬体的形成[26]。

高尔基体磷酸化蛋白3(Golgi phosphoprotein 3，GOLPH3)是一种位于反面高尔基体网状结构(trans Golgi network，TGN)上的新型外周膜蛋白，主要参与维持高尔基体正常的形态结构、受体分选、糖基化修饰以及发生于TGN上的信号通路[27]。Li等[28]研究显示：GOLPH3可作为高尔基体应激的传感器，也可作为向下游效应器触发和传播特定高尔基体应激信号的引发剂，在氧化应激过程中迅速上调，并伴随着高尔基体由位于细胞核周围的压实的带状结构到广泛分布于整个细胞质中的囊泡样结构的改变。此外，高表达的GOLPH3可促进 LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化，引发自噬和ROS产生。而ROS的过度积累会破坏细胞的稳态，导致氧化应激，促进自噬和细胞凋亡的发生[2]。

2.2 高尔基体物质转运与自噬体的形成在自噬体的相关研究中，通常选择转染能表达绿色荧光蛋白的GFP-LC3质粒，通过绿色荧光的点状聚集标记自噬体的形成。用热敏感性的水泡型口炎病毒质粒转染细胞，当合成的蛋白质离开高尔基体到达细胞膜时，有大量代表自噬体的LC3阳性囊泡形成；当使用抑制剂或诱导形成突变体以抑制TGN上网格蛋白的形成时，可以明显抑制高尔基体向细胞膜的物质转运，同样自噬体的形成也受到明显抑制，提示TGN向细胞膜的蛋白转运在自噬体的形成中发挥重要作用。TGN是早期LC3的组装位点，当自噬发生时，LC3可以与特定的TGN膜结构结合，然后从TGN上分离形成自噬体，这也从另外一个方面表明TGN很有可能为自噬体的形成提供膜来源[29]。

2.3 高尔基体与自噬体相关蛋白自噬体相关蛋白对自噬体的形成必不可少，其在细胞内有广泛的分布。在哺乳动物细胞中，自噬相关蛋白ATG9是一种六次跨膜蛋白，主要定位于TGN上，可以在TGN和早期核内体之间循环[27]，对自噬体双层膜结构的形成必不可少。激活增强子结合蛋白4(AP-4)作为一种参与真核细胞内膜系统中蛋白质分选的异源四聚体衔接蛋白复合物，可以促使ATG9A从TGN向外周细胞质的输出，有助于自噬蛋白LC3的脂化，作为自噬调节剂改变自噬[30-31]。驻留于高尔基体的小GTP酶Rab33B，可以与ATG 16L相互作用，是隔离膜形成的一个重要因素，两者共同参与调控自噬体的形成[32]。

另外，自噬作为细胞内蛋白的降解过程，Beclin1也参与其中。Beclin1是哺乳动物细胞内ATG6蛋白的同源物，主要位于TGN上，并且可以作为第三类PI3K复合物的一部分发挥作用，调控其他自噬体相关蛋白定位到早期自噬体上[26]，对自噬体的形成起重要作用。另外，Beclin1引发的自噬也是成骨细胞终末分化的必要条件[33]。间接免疫荧光显微镜下可见：大多数Beclin1和PI3K共定位于TGN，并可发生免疫共沉淀，其对自噬的发生是必需的，二者共同调控自噬的发生。

运输蛋白颗粒(transport protein particle，TRAPP)复合体由TRAPPⅠ、TRAPPⅡ和TRAPPⅢ组成，分别在内质网至高尔基体运输、高尔基体运输和自噬中起作用。其中，TRAPPⅢ主要在高尔基复合体上发挥功能，接受来自早期核内体的逆向转运囊泡，参与自噬前体结构(PAS)的形成[34]，此外，参与自噬体形成的必不可少的ATG9的转运也依赖于TRAPPⅢ[35]。

3 高尔基体和自噬在成骨分化中的作用

自噬在诱导和促进成骨细胞分化方面具有重要作用，研究[3，16-17]证明：自噬是成骨细胞分化所必需的。高尔基体作为真核细胞中一种重要的细胞器，参与多种重要的蛋白质，包括与自噬和成骨密切相关的多种蛋白质的合成和定位，同时高尔基体作为自噬体形成的潜在的膜来源对自噬体形成有重要意义。但是，高尔基体是否可以以自噬为媒介与成骨分化产生某种联系，目前尚无足够的证据证明。另外，是否可以通过高尔基体调控自噬，取得更有效的促进成骨细胞分化的效果，进而被应用于临床骨类疾病的治疗目前尚未明确。

4 展 望

大量研究[1，3，24，30]证明：高尔基体对于自噬的发生，以及自噬对于成骨细胞的分化均存在密切的联系，是否可以以自噬为媒介，探讨高尔基体在成骨分化过程中的作用是未来的研究方向。

纳米材料因其具有超小粒径、低毒性和良好的生物相容性等优点，被广泛应用于生物学方面的研究。纳米材料被细胞摄取后，可在细胞内引起一定程度的自噬。已知纳米材料多由相应的物质经过一系列复杂的反应得到，可在一定程度上保持原物质的性质。研究[1]表明：活性二氧化硅刺激MC3T3-E1分化的过程与自噬存在着密切联系。抗坏血酸具有促进成骨细胞分化的能力[36-38]，那么用抗坏血酸合成的纳米材料，是否也会保留其有促成骨细胞分化的性质、是否也能引起自噬、以其引起的自噬和成骨效应是否也具有某种联系以及是否可以通过高尔基体调节自噬使其具有更好的促成骨能力等将在以后的研究中进一步验证。