急性白血病病人WT1 mRNA表达及临床意义

(株洲市中心医院，湖南 株洲 412007 1 血液科实验室； 2 血液科)

肾母细胞瘤基因1(WT1)基因最早于1990年由CALL从儿童肾母细胞瘤中分离并鉴定出来[1]，定位于人染色体11p13。研究证实其编码的锌指蛋白具有转录激活和抑制双重功能，在调控细胞的生长和分化中发挥着重要作用[2]。本研究通过对我院初治急性白血病(AL)病人治疗各阶段骨髓中WT1 mRNA表达水平检测，进一步探讨其表达水平与病人病程及预后关系。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年2月—2016年12月于我院就诊的初诊为AL病人65例，其中男40例，女25例；平均年龄(51.3±18.5)岁。所有病人均经骨髓细胞学、流式免疫分型、染色体以及融合基因检测确诊，按照FAB标准进行分型：急性淋巴细胞白血病(ALL)8例，急性髓系白血病(AML)54例(其中M2 22例，M3 14例，M5 18例)，急性混合细胞性白血病(AMLL)1例，骨髓增生异常综合征急变M2 1例，慢性粒细胞白血病急变M2 1例。同期选择健康志愿者10例和再生障碍性贫血10例作为对照组。初诊AL病人及治疗各阶段所取标本均为骨髓标本，对照组中健康志愿者为外周血标本，再生障碍性贫血为骨髓标本。

1.2 仪器与试剂

红细胞裂解液(天根生化科技有限公司)，WT1 mRNA检测试剂盒(上海源奇生物医药科技有限公司)，ABI7300荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.3 研究方法

1.3.1细胞总RNA的提取 取EDTA抗凝的病人骨髓或外周血适量，加入2倍体积的红细胞裂解液与之混匀，置4 ℃冰箱10 min(红细胞破裂，呈红色透明状)，后以5 000 r/min离心2～4 min，弃上清液保留沉淀(可再清洗1次)，在沉淀中加入适量DEPC-H2O，制成细胞悬液。取100 μL细胞悬液，加入3倍体积Trizol，彻底混匀，采用Trizol法提取细胞总RNA，4 ℃保存RQ-PCR待用。

1.3.2WT1 mRNA表达的检测 采用RQ-PCR一步法检测病人骨髓或外周血中WT1 mRNA的表达，以ABL为内参基因。目的基因(或内参基因)反应体系：目的基因(或内参基因)反应液8 μL+酶液2 μL+RNA 15 μL，总体积为25 μL。反应条件为：42 ℃ 30 min；94 ℃预变性5 min；然后94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共进行40个循环。获得扩增曲线，得到WT1基因及ABL基因检测浓度。WT1 mRNA相对表达量=(WT1基因检测浓度/ABL基因检测浓度)×100%。以骨髓中WT1 mRNA的相对表达量>0.55%为阳性，外周血中WT1 mRNA相对表达量>0为阳性。

2 结 果

2.1 对照组及AL组WT1 mRNA的表达

65例AL病人51例骨髓中WT1 mRNA表达阳性，阳性表达率为78.5%；其中8例ALL病人中5例表达阳性,阳性表达率为62.5%；56例AML病人中45例表达阳性，阳性表达率为80.4%，该基因在ALL及AML骨髓中表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。1例AMLL病人骨髓中WT1 mRNA相对表达量为272.3%。对照组骨髓和外周血中均未检测到WT1 mRNA的表达。AML中M2、M3、M5亚型病人骨髓中WT1 mRNA相对表达量中位数分别为50.65%、162.2%、39.29%，初诊AL病人各亚型间(排除AMLL)骨髓中WT1 mRNA相对表达量差异有显著性(χ2=433.878,P<0.01)；M2、M5亚型病人WT1 mRNA的相对表达量均明显低于M3亚型病人(Z=-15.266、-19.147,P<0.01)；M2亚型病人WT1 mRNA相对表达量明显高于M5亚型病人(Z=-4.518,P<0.01)。

2.2 WT1 mRNA表达与病人预后的关系

经标准方案化疗后，随访观察12个月，排除死亡及脱访者，动态监测53例AL病人WT1 mRNA的表达，其中40例达到CR，5例NR，8例复发，其中4例WT1 mRNA已转阴的病人在临床提示CR时WT1 mRNA转为阳性，而此时血常规及形态学均提示CR，比形态学确认的临床复发提前了平均(68±18.67)d。根据病人的疗效，将其分为初诊组、复发组、NR组、CR组。初诊组、复发组、NR组、CR组WT1 mRNA相对表达量中位数分别为34.5%、59.4%、79.6%、0。初诊组、复发组、NR组WT1 mRNA的相对表达量均显著高于CR组，差异有显著性(Z=-6.089～-5.450，P<0.01)；初诊组、复发组与NR组WT1 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

初诊时WT1 mRNA阳性的39例病人中获得完全缓解26例，复发8例，CR率为66.67%，复发率为20.5%，WT1 mRNA阴性的14例病人中获得完全缓解14例，CR率为100%，复发率为0，两者CR率比较差异有统计学意义(P=0.012)，两者复发率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

大量研究表明，WT1基因是抑癌基因，同时又发挥癌基因样作用，在血液系统恶性疾病中起非常重要的作用[3-4]。本研究发现，WT1 mRNA在AL的骨髓中有较高表达，在正常人的骨髓或外周血中未检测到其表达，与文献报道的在白血病细胞中高表达，在正常成熟细胞中无表达或者极微量表达一致[5-6]，说明WT1基因与AL的发生发展有关，可能参与了白血病细胞的分化[7-8]。本研究结果显示，ALL、AML病人骨髓中WT1 mRNA表达阳性率分别为62.5% 和80.4%，两组阳性率比较差异无统计学意义，这与国内外相关研究结果一致[5,9-10]。在AML各亚型中，M3组WT1 mRNA相对表达水平最高，其次是M2，再次是M5，这也与相关文献报道的结果一致[11-12]。国内外学者研究结果[3,5-6]和本研究结果均证明 WT1 mRNA 在AL中过表达，且具有较高的阳性率，提示WT1 mRNA检测可具有更广泛的临床应用价值，尤其是对于无特异分子学标记的AL。

本研究跟踪随访53例AL病人，对其不同转归进行分组，比较他们之间的WT1 mRNA表达水平，初诊组、复发组、NR组病人的WT1 mRNA表达水平显著高于CR组。提示WT1 mRNA的表达水平可作为评估疾病疗效、预测疾病转归的有效指标之一，特别是对于无特异性基因标志的白血病病人。有学者分析AML病人WT1 mRNA的表达，结果显示WT1高表达组治疗后1年CR率低于WT1低表达组，而两组复发率比较差异无显著性[13-14]，这与本研究结果基本一致。而陆丽娜等[15]对AML病人预后研究显示，WT1增高组比WT1正常组复发率更高，差异有统计学意义，但是与本研究结果有一定差异，可能与治疗方案及疾病结构组成不同有关。

AL是血液系统常见的恶性肿瘤之一，目前随着治疗方法和药物的更新，缓解率已经得到了很大提高，但是白血病易复发仍是治疗中难以攻克的难题，微小残留病灶(MRD)是导致复发的直接原因，与病人预后密切相关，动态监测MRD能有助于监测治疗效果以及早期预测血液学复发情况[16-18]。本研究动态观察WT1 mRNA不同疾病阶段的表达，结果显示初诊WT1 mRNA阳性表达病人随着治疗的好转 WT1 mRNA 表达水平逐渐下降直至转阴，WT1 mRNA已转阴的病人随着病情的复发 WT1 mRNA可转阳，并且可早于临床指标提示的复发，WT1 mRNA表达阳性且未达到CR的病人WT1 mRNA表达持续阳性，WT1 mRNA 阳性表达组具有更低的缓解率。提示 WT1 mRNA可作为评估治疗效果、判断预后、预测复发及MRD监测的临床指标之一。这与国内相关研究结果一致[19-20]，与国外学者认为WT1可以作为一种新的泛白血病基因用于MRD的监测以及预测复发的结论也是一致的[18,21]。

综上所述，应用RQ-PCR一步法可以高效快速地检测AL病人WT1 mRNA表达水平，具有重要的临床价值，对AL病人疾病的进展、疗效的监测、判断预后、预测复发及MRD的监测均有重要意义，尤其是对于无特异性分子学标志物的白血病，为临床个体化精准治疗提供更可靠的依据。