微小RNA在干细胞向胰岛素分泌细胞转化过程中表达的研究进展

潘 贵，刘建萍

(南昌大学第二附属医院内分泌科，江西 南昌 330000)

糖尿病是一组由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，是由于胰岛β细胞被破坏或胰岛素合成及作用途径被阻断所造成血糖异常。长期高血糖状态会引发多种严重的并发症，如心血管疾病、肾功能衰竭和视网膜病变等。研究[1]显示：2013年，全球有3.82亿成人患糖尿病，到2035年，这一数字预计达到5.92亿，将会给社会带来沉重的经济负担和卫生负担。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一类长度约为22nt的内源性非编码RNA，已被证实参与了许多疾病的发病过程，包括癌症、细菌、病毒感染以及糖尿病。可通过靶向miRNA 或阻止其翻译相关蛋白来抑制基因的表达。miRNA是哺乳动物基因组中最为丰富的调节基因之一，在细胞发育中起重要作用[2]。miRNA是葡萄糖动态平衡的调节器，在基因表达的转录后调节过程中起关键作用，对胰岛素分泌和胰岛素抵抗有一定的调节作用，同时对胰岛β细胞的分化和再生以及胰岛的发育有重要的调控作用[3-5]。1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，可受遗传和环境等多重复杂因素的影响，以胰岛β细胞的死亡为其主要的病理特征，但目前对于1型糖尿病的发病机制尚未清楚，miRNA可能成为解决这一难题突破口[6-7]。近年来，国内外研究者越来越多地将目光聚焦在研究干细胞治疗糖尿病的方法上。干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，干细胞可以分化成多种功能细胞，多位学者已经成功地将各种来源的干细胞分化成有功能的胰岛素分泌细胞(insulin producing cells,IPCs)。目前可用于β细胞替代治疗的干细胞来源主要有胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)、诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)以及成体干细胞[8]。既往对miRNA在糖尿病发展过程中的作用机制研究较多，但在各类干细胞分化成胰岛素分泌细胞过程中miRNA的表达情况尚未见综述报道，本文主要对miRNA在各种来源的干细胞向IPCs分化过程中的表达情况进行综述。

1 ESCs向IPCs分化过程中关键miRNA的表达

ESCs是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境中，ESCs均能被诱导分化为机体内几乎所有的细胞类型，在特定的体外培养环境下其可以被诱导成IPCs[9]。Sulzbacher等[10]通过激活素A的诱导作用成功地将ESCs转化成内胚层和胰腺细胞。Wei等[11]在将ESCs诱导成IPCs的过程中，发现miR-375和miR-7的动态表达模式与人胎儿胰腺发育过程中的动态表达模式相似，而miR-146a和miR-34a的动态表达则显示出特异性W模式。miR-375和miR-7的预测靶基因Hnf1β和Pax6的表达与miR-375和miR-7的表达呈负相关关系，miR-375的过表达可以下调肠内皮细胞/胰腺祖细胞(pancreatic progenitor cells,PPCs)特异性标记基因Hnf1β和Sox9的表达，miR-375表达水平的升高和降低对于胰岛细胞的产生和成熟功能非常重要。在miR-34a表达水平最低的第6天和第10天，PPCs分别开始被诱导和诱导成功，而在miR-146a表达水平最低的第14和19天，出现表达内分泌激素的细胞和接近分化末端的细胞，说明miR-34a和miR-146a可能分别在PPCs形成过程和PPCs分化成IPCs过程中起作用。因此，miRNA可以直接或间接调节胰岛细胞器官发生特异性转录因子的表达，以控制胰岛细胞的分化和成熟。研究[12]显示：用含有人miR-375前体的慢病毒载体转染人胚胎干细胞(hESCs)，miR-375表达稳定且明显，在实验最后阶段聚集形成的人类胚状体表现出与成熟胰岛相似的特征，表明miR-375转染hESCs后向胰腺谱系分化的可行性。Guay等[13]发现：miR-375在胰腺α细胞中发挥更重要的作用。在miR-375被敲除的动物中α细胞数量和胰高血糖素水平升高，从而导致慢性高血糖症，因此在将ESCs转分化成IPCs的过程中，miRNA的表达至关重要，通过有效调节与IPCs形成密切相关的miRNA的表达可以优化转分化方案，提高转分化效率。

2 iPSCs向IPCs分化过程中关键miRNA表达

iPSCs是通过基因转染技术使体细胞直接重构成为ESCs样的多潜能细胞。多位研究者[14]已成功地将iPSCs诱导分化成IPCs。Alipio等[15]利用iPSCs成功地诱导出类似于小鼠内源性IPCs的β样细胞，这些β样细胞在葡萄糖刺激下分泌胰岛素，并通过iPSCs移植来改善1型和2型糖尿病小鼠模型的高血糖表型。Sebastiani等[16]在将iPSCs诱导成IPCs过程中观察到大量miRNA的差异表达，其中11个miRNA表达水平上调(miR-9-5p、miR-9-3p、miR-10a、miR-99a-3p、miR-124a、miR-135a、miR-138、miR-149、miR-211、miR-342-3p和miR-375)，7个miRNA表达水平下调(miR-31、miR-127、miR-143、miR-302c-3p、miR-373、miR-518b和miR-520c-3p)，这些miRNA调控参与胰腺发育过程或内分泌胰腺细胞命运的特异性靶基因。Shaer等[17]使用转染试剂将hsa-microRNA-7转染至人源性多能干细胞集落，化学转染后观察到细胞形态表现发生变化，并形成了细胞簇，胰腺特异性转录因子的表达水平在第1天升高，在第2天明显升高，证实了胰岛素和Ngn3蛋白的存在，从而证实miR-7转录因子网络在胰腺发育过程中起重要作用,采用miR-7进行化学转染可以在短时间内将人iPSCs分化成胰岛样功能细胞簇。Shaer等[18]通过实验也证实了miR-186和miR-375的过表达在短时间内可将人iPSCs分化成胰岛样细胞簇，并使胰岛发育相关基因(Pdx1、Pax4、Pax6、Kir6.2和Nkx6.1等)表达水平升高,表明miR-186和miR-375的过表达可能是诱导胰岛样细胞簇形成的替代方案。

3 成体干细胞向IPCs分化过程中关键miRNA表达

成体干细胞是成体组织中保留的未分化完全的原始细胞，存在于体内各个脏器中，在一定条件下，成体干细胞可以跨越传统胚层概念的界限，分化成其他胚层的干细胞。目前研究较多的主要有肝干细胞、间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)和胰腺干细胞。

3.1 肝干细胞 腹侧胰腺和肝脏具有共同的发育起源，均来源于内胚层，二者中均有血糖浓度的变化。在一定条件下可以将肝干细胞成功的诱导成IPCs[19-22]。Lu等[23]采用miR-302类似物和表达Pdx1、Ngn3和MafA的质粒感染人类肝细胞系HL-7702，通过28 d的诱导方案对肝细胞进行诱导，过表达miR-302a 可增加胰腺发育相关基因Sox9、Foxa2和内生性Pdx1 的表达，最终获得能分泌胰岛素的细胞，其在体外能够对生理性血糖浓度的变化做出反应并释放胰岛素，这表明miR-302的参与可能在肝细胞转化成胰岛样细胞过程中发挥关键的调节作用。由于肝细胞的来源特殊，如果能发现肝干细胞向IPCs分化过程中起关键作用的miRNA，探索出更加优化的诱导方案，将对糖尿病的治疗起至关重要的作用。

3.2 MSCs MSCs是一类存在于多种组织(如骨髓、脐带血、脐带组织、胎盘组织和脂肪组织等)、具有多向分化潜力、非造血干细胞的成体干细胞[24]。已有多位学者[25-26]成功将MSCs诱导为IPCs。miR-375是胰岛组织特异表达的miRNA，不仅能参与胰岛素的分泌过程，而且与胰岛素的合成过程也密切相关。Bai等[27]发现：miR-375可通过抑制靶基因Mtpn和Sox6来诱导脐带间充质细胞(N-UCMSCs)分化为IPCs。肌营养不良蛋白是Mtpn的蛋白质产物，在β细胞根据血糖变化释放胰岛素的过程中起重要作用,通过敲除Mtpn可以模拟miR-375过表达对胰岛素分泌的影响[28]。在小鼠体内过表达miR-26a不仅能增加出生后胰岛细胞数量，同时在体外也能增加内分泌/腺泡集落[29]。miR-26a通过靶向Sox6、Ccnd1和Bhlhe22来诱导IPCs的形成，miR-26a和miR-375共同作用能够诱导MSCs到IPCs的交叉胚层分化[27]。Piran等[30]用含miR-375的慢病毒转染从糖尿病患者的脂肪组织中提取的脂肪间充质干细胞(adipose tissue derived stromal cells,ADSCs)，在经过一系列的诱导过程后，形成的胰岛样细胞簇特异性基因包括insulin和Pdx1以及基因相对应的蛋白表达水平明显升高，说明过表达miR-375可以使ADSCs转化成胰岛样细胞簇。Hlxb9基因在成人胰腺中表达明显，在IPCs分化期间发挥关键作用。Mu等[31]发现：在骨髓间充质干细胞(MSCs)向IPCs分化过程中，miR-200a和miR-141可以通过结合Hlxb9基因的mRNA 30UTR来抑制Hlxb9基因的表达。 miR-200a和miR-141的过表达可下调PPCs标志物Hlxb9和Pdx1的表达。因此，miR-200a和miR-141可以直接或间接调节胰岛转录因子的表达以控制IPCs的分化。Jafarian等[32]发现：miR-375和抗miR-9的协同作用可以将人MSCs诱导分化成胰岛样细胞簇，这些发现突出了miRNA在干细胞分化过程中的作用，表明miRNA可以作为糖尿病基因治疗的工具。

3.3 胰腺干细胞 成年胰腺中存在着干细胞，胰腺干细胞能分化形成胰腺导管、胰岛和胰腺外分泌腺腺泡等特定的胰腺组织细胞，是具有多向分化能力和自我更新的未分化细胞。由于胰腺干细胞缺乏特异性的分子标志，其分离和纯化还存在着一定的困难[33]。Bai等[34]为了研究miR-21在PPCs向IPCs分化过程中的调节作用，分别过表达和抑制了miR-21，并在PPCs中表达miR-21靶基因的小干扰RNA。小干扰RNA被用来敲除miR-21在PPCs中靶基因，以阐明这些基因在IPCs形成过程中的作用，miR-21通过调节靶基因和下游基因(Sox6、Rpbj和Hes1)的表达成为IPCs形成的双向开关，说明内源性miRNA在IPCs的形成过程中起重要调节作用。

4 展 望

miRNA在基因表达和调控方面的重要作用已经得到了充分的证实，且已经被广泛地运用于人类生理和疾病方面的研究。在胰腺的发育过程中，miRNA调控多种胰腺发育相关的特异性转录因子的表达，同时，这些转录因子又反过来调控miRNA，构成了复杂的分子调控网络，在胰腺形成过程中起重要作用。在各种干细胞定向分化的过程中，可通过过表达或抑制某些miRNA来调节和改变干细胞既定的分化方向，朝着胰腺形成的过程分化，最终获得可以有效分泌胰岛素的胰腺β细胞，为糖尿病治疗提供一种新的手段和策略。因此，对于miRNA在干细胞向IPCs分化、成熟及胰岛素分泌过程中的作用进行深入的研究，不仅有助于阐明IPCs分化过程的分子机制，建立将各种干细胞分化成IPCs的新策略，同时也有助于探索获得能分泌足够胰岛素的IPCs，为糖尿病的改善和治疗提供新的方法和思路。

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