泛素化修饰与细胞自噬

崔钰晗，宋 迪，刘 月，关宇鹤，陈蒙蒙，陈 凡，王 洁，杨 波

(新乡医学院医学检验学院，河南 新乡 453003)

自噬主要是指细胞吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，通过溶酶体进行降解的过程。在生理情况下，自噬对于细胞存活、分化、发育以及稳态的维持均至关重要。泛素化修饰在自噬调控方面起着重要作用。自噬的相关分子蛋白Unc-51样自噬激活激酶1(Unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)、自噬相关基因6同源物(autophagy related 6 homolog，ATG6)Beclin-1等存在泛素化修饰，因此，寻找其调控分子及泛素化修饰位点，对于探讨自噬的发生机制具有重要意义。

1 自噬

自噬主要是通过细胞膜结构包裹部分细胞质和需要降解的受损细胞器、蛋白质等形成自噬体，然后与溶酶体融合形成自噬-溶酶体，通过溶酶体内部的各种水解酶降解其所包裹的内容物，从而清除损伤的细胞器和错误折叠的蛋白质，降解产物作为细胞再生与修复的原料，以实现废物利用[1]。自噬作为一种机体防御和应激的调节机制，参与一系列生理和病理过程。研究发现，如果无适当的调控，自噬会导致各种疾病，包括癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病以及神经退行性病变等[2]。根据细胞内成分进入溶酶体方式的不同，自噬主要分为3种类型：大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自体吞噬[3]。大自噬所能降解的蛋白种类最为广泛，本文介绍的自噬主要是指大自噬。

自噬的发生起始于自噬小体形成，自噬小体形成又依赖于一系列自噬相关蛋白(autophagy-related gene，ATG)的参与[4]。迄今为止，在酵母中已发现40余种ATG家族成员，大多数在人体内具有同源物[5]。然而，只有不到50%的ATG蛋白对于经典自噬小体的形成是必要的，包括ATG 1～10、12～14、16～18、29和31[6]。在经典的自噬信号通路中，有2种类泛素的结合系统：ATG12耦合系统和微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3，MAP-LC3)/ATG8脂联系统，这2套系统均需要同一个泛素激活酶E1 (ubiquitin-activating enzyme，E1)ATG7的参与[7]。在ATG12耦合系统中，ATG7促进ATG12-ATG5复合物的形成[8]；在LC3脂联系统中，ATG7促进LC3-I形成LC3-磷脂酰乙醇胺复合物，也被称为LC3-Ⅱ，是目前最广泛使用的自噬标志物[9]。目前研究表明，细胞自噬在组织稳态、人类疾病(如肿瘤、神经退行性病变、感染等)、免疫和衰老中发挥了举足轻重的作用[10]。

2 泛素化修饰

76个氨基酸组成的泛素分子是具有高度保守性的小分子蛋白质，在真核生物细胞中分布广泛。在酶的介导下，泛素分子与蛋白质结合，使靶蛋白被26S蛋白酶体识别并降解。泛素化是一个复杂的过程，作为一种重要的蛋白质翻译后修饰，泛素化修饰在多种酶的参与下完成。参与泛素化修饰的酶主要包括泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3，其中，泛素激活酶E1和泛素结合酶E2特异性较差，靶蛋白的选择主要是由泛素连接酶E3决定[11]。泛素化修饰主要分为3个步骤进行：第 1 步，在三磷腺苷水解提供能量的情况下，泛素激活酶E1与泛素分子C末端的半胱氨酸残基结合，激活泛素分子；第2步，泛素激活酶E1将活化的泛素分子转移到泛素结合酶E2上；第3步，泛素连接酶E3将泛素结合酶E2上的泛素分子转移到靶蛋白上，完成泛素化修饰[12]。

泛素化修饰根据泛素分子的连接方式可以分为单泛素化修饰和多聚泛素化。只有1个泛素分子连接在靶蛋白的赖氨酸残基上称为单泛素化；而多个泛素分子结合形成链状连接在靶蛋白的赖氨酸残基上称为多聚泛素化。目前，单泛素化修饰报道较少，关于泛素化修饰的研究主要集中在多聚泛素化修饰上，包括K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63位连接修饰[13]，其中对K48和K63位多聚泛素化研究最为广泛。K48位多聚泛素化修饰主要促进靶蛋白通过蛋白酶体发生降解，K63位多聚泛素化修饰则调节靶蛋白功能。泛素化修饰在许多生理功能中发挥作用，已经成为现阶段新的研究热点。

3 自噬过程中的泛素化修饰

近年来，有关ATG蛋白翻译后修饰的研究越来越多，比较常见的包括磷酸化、糖基化、泛素化及乙酰化等[14]，目前研究最多最为透彻的是磷酸化修饰。自噬关键分子ULK1、Beclin-1等存在泛素化修饰，并影响自噬的形成，提示泛素化修饰在自噬的发生、发展过程中扮演重要角色。

3.1ULK1在酵母中，细胞自噬的形成需要多达40个分子的参与，而在哺乳动物细胞中需要更多。细胞自噬通过ULKl复合物得以启动。ULK1是一个丝氨酸/苏氨酸激酶，是重要的人类细胞自噬相关蛋白之一，位于人类12号染色体的q24.3。ULK1是由人ULK1基因编码的酶，其在酵母中的同源分子是ATG1[15]。酵母中ULK复合物含有ATG1和ATG13等组分，而哺乳动物中的ULK复合物除了ULK1、ULK2和ATG13，还包含ATG101和局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)家族相互作用蛋白200(FAK-family interacting protein of 200，FIP200)等蛋白质[16]。哺乳动物基因组中ULK1同源家族成员很多，包括ULK1、ULK2、ULK3、ULK4和STK36[17]，这些蛋白都包含一个保守的N端结构域。目前已知ULKl和ULK2在细胞自噬中发挥重要作用，在小鼠胚胎成纤维细胞中同时敲除ULKl和ULK2可以显著抑制依赖于营养的细胞自噬[18]。在ULK1复合物中，ULK1通过其C末端直接与FIP200结合，而ATG13则能够增强ULK1和FIP200的结合[19]。FIP200与ATG13共同调节了ULK1在自噬过程中的激酶活性。ULK1-ATG13-FIP200复合物的形成不会因营养条件的变化而改变，而在营养富足状态下，哺乳动物西罗莫司靶蛋白1与ULK1复合物相互作用，下调ULK1复合物的活性，自噬发生被抑制。西罗莫司诱导或者饥饿状态下，哺乳动物西罗莫司靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex-1，mTORC1)与ULK1复合物解离，使ULK1的活性得以恢复，促进自噬形成[20]。

K63泛素链在自噬形成过程中具有重要作用。有研究表明，Beclin-1调控自噬激活分子(activating molecule in Beclin-1 regulated autophagy，AMBRA1)通过与肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumour necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)相互作用，促进ULK1的K63位连接的泛素化修饰，进而提高其稳定性，促进自噬的发生[21]。TRAF6过表达后，发现本底和饥饿诱导条件下自噬形成增多；然而，将AMBRA1敲低以后，TRAF6过表达诱导自噬的能力有所降低，表明TRAF6诱导自噬可能依赖于AMBRA1[22]。进一步研究发现，TRAF6与AMBRA1和ULK1存在明显的共定位，当下调AMBRA1表达时，TRAF6与ULK1相互作用的能力受到影响，说明AMBRA1对于TRAF6-ULK1的泛素化修饰在它们诱导自噬的过程中具有重要作用[23]。

LEE等[24]研究发现，Cul3-KLHL20泛素连接酶可以通过泛素化修饰促进ULK1降解来终结自噬的发生，而Kelch样蛋白20(Kelch-like protein 20，KLHL20)基因敲除增加了ULK1的蛋白稳定性。此外，在Roc1-Cul3-KLHL20复合物存在下，ULK1在体外系统中发生了泛素化修饰，这些结果提示，ULK1很可能是E3连接酶KLHL20的直接底物。KLHL20过度表达下调了ULK1的蛋白水平，并且，在KLHL20的Cul3结合缺陷型突变体中未观察到这种现象，提示KLHL20功能的发挥依赖于和Cul3的结合。KLHL20诱导的ULK1表达下调可以被蛋白酶体抑制剂MG132恢复，说明KLHL20依赖性ULK1降解是通过蛋白酶体途径的。ALEMU等[25]研究发现，在饥饿环境下，ULK1蛋白水平逐渐下降，并且随着饥饿时间的延长，ULK1 K48位泛素化修饰程度增加，这与LEE等[24]的研究相吻合。因此，KLHL20介导饥饿诱导的ULK1泛素化修饰和降解有助于自噬的终止[26]。

3.2Beclin-1Beclin-1是酵母中ATG6/空泡蛋白分选30(vacuolar protein-sorting 30，VPS30)的同源基因，是哺乳动物细胞参与自噬的关键节点分子。研究表明，Beclin-1不仅参与自噬体的形成，还能够通过调节自噬活性参与肿瘤的发生、发展[27]。在自噬发生过程中，自噬与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)复制的调控密切相关。HBV X蛋白是HBV生物学过程中的一种多功能调节因子，其对HBV自噬诱导至关重要，HBV X蛋白通过上调Beclin-1蛋白表达而增加自噬体的形成[28]；神经元前体细胞表达发育下调4(neuronal precursor cell expressed developmentally downregulation 4，NEDD4)在病毒感染过程中发挥着重要的作用，NEDD4通过与Beclin-1相互作用来抑制结核分枝杆菌和李斯特菌的复制，从而促进自噬的发生[29]。另外，抗凋亡蛋白Bcl-2在酵母和哺乳动物细胞中通过抑制Beclin-1的功能而削弱饥饿诱导的自噬体的发生[30]。在自噬发生过程中，Beclin-1蛋白存在多种翻译后修饰，包括泛素化修饰，但泛素化修饰精确调节Beclin-1的机制仍然报道不多。

锌指蛋白216 (ring finger protein 216，RNF216)是一种泛素连接酶，能够强烈抑制巨噬细胞中的自噬。RNF216能够与Beclin-1相互作用，促进Beclin-1的K48位连接的泛素化修饰。在肺泡巨噬细胞中过表达RNF216可抑制自噬的发生，而敲低RNF216可显著抑制这些结果[31]。泛素连接酶NEDD4能促进Beclin-1的赖氨酸第11位(lysine-11，K11)连接的泛素化修饰，影响Beclin-1的稳定性。而VPS34敲除以后，NEDD4介导的Beclin-1 K11位连接的泛素化修饰增强，导致其蛋白酶体降解增加，从而抑制自噬的发生[32]。因此，NEDD4和RNF216对Beclin-1进行K11和K48位泛素化修饰，导致其降解并抑制自噬的发生。研究发现，Beclin-1蛋白K437位点可以发生K11连接的泛素化修饰，对其蛋白稳定性是必需的；然而，抑制K437位点的K11连接的泛素化修饰能够抑制Beclin-1的降解，促进细胞自噬的发生[33]。而去泛素化酶泛素特异性蛋白酶19能够将K437位的K11泛素链降解，通过增强Beclin-1蛋白稳定性而促进自噬的发生[34]。

研究表明，在小鼠胚胎成纤维细胞发生自噬的过程中，E3连接酶AMBRA1 能够使Beclin-1发生K63位的泛素化修饰，从而增强VPS34活性；而Wiskott-Aldrich综合征蛋白通过与Beclin-1相互作用来抑制Beclin-1泛素化修饰，以灭活VPS34活性，从而抑制自噬[35]，说明Beclin-1-VPS34复合物中Beclin-1的泛素化修饰不仅影响其自身功能，也能影响其“伙伴”的功能。在Toll样受体4诱导的自噬过程中，TRAF6介导的Beclin-1 K63位泛素化修饰至关重要；而去泛素化酶肿瘤坏死因子诱导蛋白3则通过减少Beclin-1 K63位泛素化修饰，从而抑制Toll样受体信号诱导的自噬。此外，用白细胞介素-1或干扰素刺激Raw 264.7细胞，或饥饿处理其他细胞，均能够增强Beclin-1 K63位连接的泛素化修饰，促进自噬体的形成。这些结果表明了Beclin-1 K63位泛素化修饰在自噬的形成中具有重要的作用。

3.3其他分子VPS34是Ⅲ类磷脂酰肌醇激酶复合物中的催化亚单位，在自噬中起着重要的调节作用。它由催化亚基VPS34和调节亚基VPS15组成，能够催化磷脂酰肌醇生成磷脂酰肌醇3-磷酸[36]。F盒富含亮氨酸的重复蛋白20(F-box and leucine-rich repeat protein 20，FBXL20)是一种F盒蛋白，与CUL1、S段激酶相关蛋白1(S-phase kinase-associated protein-1，SKP1)形成SKP1-CUL1-F盒蛋白质(SKP1-CUL1-F-box protein，SCF)复合物共同行使泛素连接酶功能。然而，细胞外信号是如何调节VPS34复合物及其下游信号转导途径的，目前尚不清楚。研究发现，在DNA损伤条件下，p53的激活能增加FBXL20转录，促进SCF复合物对VPS34的泛素化修饰，导致其降解，最终抑制自噬[36]。进一步研究发现，DNA损伤导致有丝分裂停滞及CDK的活化，进而使VPS34发生磷酸化修饰，而泛素连接酶E3识别磷酸化的VPS34，使其发生泛素化修饰而被蛋白酶体识别、降解[37]。

mTORC1是自噬调控的上游分子，主要通过与ULK1复合物结合而抑制自噬的发生。由结节硬化复合物1(tuberous sclerosis 1，TSC1)与TSC2结合形成的TSC蛋白复合物具有GTP酶活性，是mTORC1的主要调控因子。有研究表明，活化的突触前密度蛋白连接激酶能够磷酸化TSC2，从而阻止TSC2与TSC1结合，抑制TSC复合物的形成，解除对mTORC1活性的抑制[38]。另外，RNF家族的一些成员通过K63位泛素链修饰而调节mTORC1的功能，如泛素连接酶RNF152 激活 mTORC1[39]。

ATG12不仅是一种自噬相关蛋白，其本身还是一种泛素样蛋白，能够直接被泛素化修饰，通过蛋白酶体降解而抑制自噬的发生。同时，ATG12、ATG5和ATG16L结合形成的复合物能够发挥类泛素连接酶活性，参与LC3脂化过程，对自噬的形成是必需的。

4 结语

近年来，自噬已成为医学研究的热点，越来越多的研究者关注泛素化修饰在自噬发生过程中的调节功能。ATG蛋白参与自噬形成的各个阶段，机体通过对ATG蛋白进行泛素化修饰来调控自噬的发生与终结。目前，关于ATG蛋白泛素化修饰的研究主要集中在Beclin-1和ULK1，其他参与自噬形成的ATG蛋白则鲜有报道。对于这些分子的泛素化修饰的研究，有助于进一步认识自噬发生及其终结的具体机制，为临床治疗自噬相关疾病提供理论基础及可能的治疗靶点。