富血小板纤维蛋白促进口腔软组织形成的研究进展

李雨阳 李保胜 蔡 青 王春阳 王昊阳 孟维艳

作者单位：130021长春，吉林大学口腔医院种植科·吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室（孟维艳为通讯作者）

血小板是一种存在哺乳动物血液中的有形成分，由骨髓中成熟的巨核细胞胞质裂解脱而来的具有生物活性的小块胞质，参与止血、血栓形成、创口修复以及促进血管形成[1]。2000年Choukroun等[2]通过改良制备了新的血小板浓缩品富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）。与之前研究出的富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）相比，PRF 无需添加抗凝剂、凝血酶等试剂，制作简单，且长远来看可以更稳定地释放生长因子[3，4]，又称为Choukroun’s PRF。2006 年，Sacco通过静脉血制备了浓缩生长因子（concentrate growth factors，CGF）[5]，其在制备时采用了不同的离心速度，但是与PRF有着相似的成分。PRF作为第二代血小板浓缩物，由自体血经梯度离心获得，较好地避免了过敏反应和免疫排斥反应，且含有大量生物因子，对组织修复具有良好的促进作用[6，7]。目前，PRF膜作为一种自体生物材料已广泛应用于口腔种植、美容、骨科及皮肤科等多个领域。

一、PRF的基本特性

1.PRF的制备

收集新鲜的静脉血10ml于未加抗凝剂的干燥离心管中以3000r/min的速度离心10分钟后可见分层，最上层为血浆，最下层为红细胞，中间白色凝胶状物质即为PRF。其实，设备的种类对PRF的制备也会产生影响[8]，很多研究者根据离心速度和时间来调试制备PRF，而忽略了机器离心时自身振动所产生的不良影响，随着离心速度的增加，这种不良的自身振动会导致PRF凝块或膜的扭曲，震动越大，所生成的PRF凝块长度和宽度都会有所降低，其内部结构和成分也会改变，继而导致释放生长因子数量的下降。因此，适宜的离心速度和高质量的离心设备不仅有利于PRF的制备，还可以促进细胞因子的积聚。通过无菌纱布进行挤压获得的PRF膜含有大量自体的生物因子、血小板以及白细胞等[3]，可作为良好的生物材料应用于组织修复中。

2.PRF的结构

通过扫描电镜和投射电镜观察可以发现PRF的基本结构为纤维蛋白构成的三维网状支架结构，并且有大量的白细胞和血小板位于其中[9，10]，在修复过程中可起到抑菌抗感染的作用。Bai等[11]通过兔模型发现分层的结构中PRF比血浆还有更多的血小板源生长因子BB（PDGF-BB）和转化生长因子β1（TGF-β1），并且拥有较高的孔隙率和良好的弹性，使氧气和营养物质可以渗透至周围组织，这可能是PRF促进机体修复的原因，其网状支架也是PRF能够长期释放细胞因子和生长因子的结构基础[12，13]。在电镜下，Sam[14]发现，低倍镜（×250）下 PRF膜表面呈现不规则形态，同时在膜的中央可见许多聚集的血小板（×300），而在红细胞与凝胶的红黄交界处采用高倍镜（3000）观察可见到大量球形白细胞，这也证实了PRF不仅具有修复功能，还具有防御功能。

二、PRF促进软组织形成的机制

研究发现，PRF中含有多种细胞因子[15]，这些因子可以促进组织细胞的聚集、增殖和修复反应。另外，它的三维纤维蛋白支架结构不仅为组织修复提供了场所，还保证了细胞因子长期稳定地释放，此外，它的膜结构以及内含的白细胞构成了一种防御屏障，抵抗外界致病因子的侵入。Mo等[16]发现VEGF可以通过活化NF-κB信号通路，增加核因子κB抑制因子α的磷酸化和泛素化来保护神经细胞减少缺血缺氧的损害，也有研究表示，在缺血区增加VEGF或VEGF受体的表达可以增强bFGF（basic fibroblast growth factor，bFGF）的表达，从而促进血管的生成[17]。转化生长因子β（transforming growthfactor-β，TGF-β）是一种趋化因子，不仅可以增加胶原纤维的合成、促进类平滑肌细胞的形成[18，19]，同时，它还作为一种桥梁在上皮细胞和间质细胞中起到重要作用，抑制上皮细胞内TGF-β的活化可以阻断TGF-β对成纤维细胞反应，可以进一步减少纤维的形成[20]。胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）是一种细胞增殖调控因子，在细胞增殖、分化上有促进作用。Zeilbeck[21]通过上调IGF-1的mRNA表达发现可以激活Wnt/β-catenin通路促进毛细血管生成，IGF-1也可以通过提高组蛋白去乙酰酶SirT-1的表达增加SirT-1的去乙酰作用来促进损伤唾液腺的DNA修复[22]。血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）是一种存在于血小板中α颗粒中的碱性蛋白质，可以促使多种细胞从G0期进入分裂期。PDGF-BB与bFGF的合用可以促进成纤维细胞的增殖和胶原重建[23，24]达到肌腱组织的修复，并且与其它因子相比，PDGF-BB可以更快地促进细胞增殖，提高细胞活性以及在伤口闭合的后期促进成纤维细胞的分化来达到基质的修复效果[25]。除此之外，还包括了胶原蛋白1、骨钙素（OCN）、碱性磷酸酶（ALP）等其它多种因子[26]。Ehrenfest[8]在研究白细胞-富血小板纤维蛋白（leucocyte-PRF，L-PRF）时发现，当L-PRF内细胞成分发生破坏时，它的实质更像P-PRF，尽管PRF内的多种生长因子在组织愈合的过程中扮演重要的角色，但是白细胞也同样不可或缺，它可以作为一种媒介调节生长因子的释放，可以在释放生长因子的时间和数量上达到更好的效果，这与Schär[27]的研究相一致。Choukroun[28]对PRF促进组织愈合的机制进行了总结，即血管重塑再生、免疫调节控制、干细胞的迁移增殖分化以及创口上皮的覆盖闭合。大量实验证明，PRF内含高浓度生长因子和大量细胞在促进骨、血管、纤维等组织修复和细胞迁移过程中起到重要作用，且细胞因子和白细胞在防御功能中也扮演了重要的角色，此外，空间结构和分散的细胞外基质也有利于细胞极化和群体迁移细胞间的定向耦合，继而促进角化细胞上皮再生[29]，这些都可以促进伤口的愈合，减少创口的愈合时间。一系列的研究成果都表明了PRF在制备过程简单的同时可以促进组织的愈合，为临床的应用提供了指导和理论支持。

三、PRF在口腔中的研究应用

1.牙周组织中的应用

PRF作为一种自体的生物材料对牙周组织的再生有着积极的作用。众所周知，翻瓣术有利于菌斑和牙石的刮除，达到减轻深牙周袋的作用，而PRF与翻瓣术联合应用可以提高组织生长因子的表达，促进上皮的增生，减少附着丧失，从而进一步提高牙周炎患者的龈缘水平、增加附着水平[30]；2012年，Eren[31]使用冠向复位瓣术（coronally advanced flap，CAP）和PRF进行上皮下结缔组织移植，改善了萎缩的牙龈组织的状况；Anilkumar[32]将PRF覆盖于牙龈萎缩暴露的牙根处，同样使得牙龈再生，且获得了良好的美学效果。另外，它的纤维蛋白成分也可以刺激胶原再生，促进牙周膜细胞的增殖、分化达到修复效果[33]。随着引导组织再生术（guided tissue regeneration，GTR）运用的日渐成熟，在术中使用PRF可以使牙周组织获得更好、更快的治疗效果。

2.口腔种植中的应用

近年来，随着口腔种植体体系成熟，PRF越来越广泛地应用于种植领域。许多口腔种植患者由于后牙区骨量的不足，需要进行骨增量、上颌窦提升以及引导骨再生等手术，而在新增的骨粉中混入PRF不仅可以增强成骨细胞的分化和增殖，还能促进新生血管和黏膜的形成。PRF膜除了可以防止移植骨粉的流失外，其富含的纤维蛋白也可以促进穿孔的上颌窦黏膜的修复[34]，继而较快地封闭创口。对拔牙后需要进行种植修复的患者，拔牙后若不做特殊处理，可导致牙槽嵴的吸收，影响缺牙区的美学效果，而使用位点保存技术将PRF膜与骨移植材料联合应用不仅可以避免骨缺失、防止纤维细胞和上皮细胞的向创口的迁移，还可以有效抑制创口周围软组织的萎缩[35]。此外，即刻种植时PRF可作为一种理想的软组织覆盖，释放生长因子，促进牙龈的愈合与再生[36]，保证种植的初期稳定性。PRF对于牙周组织再生的治疗也为种植体周围炎患者的治疗提供了新的研究思路。

3.牙体牙髓组织中的应用

牙髓包含着丰富的血管、神经、淋巴和结缔组织，是整个牙体组织的重要营养来源。PRF不仅能促进牙髓的分化和矿化修复牙体硬组织，针对牙髓自身疾病也有相当明显的治疗作用。对于有坏死的年轻恒牙在根管治疗时加入PRF，在12个月后可以看到牙髓内容物的再生[37]。Goel[38]在治疗畸形根面沟患者时，去除根管内感染物质、加入PRF和修复材料，30个月后用CBCT照射观察时，发现牙周膜和皮质骨得到了良好的愈合。另外，人们发现，将人的牙髓细胞的悬浮液混入自体静脉血再离心，不仅可以更好的保护PRF的支架结构，还能释放更多数量的生长因子[39]，从而更有效地进行组织修复。

四、展望

PRF是第二代血小板浓缩物，是一种天然的血凝块，作为自体生物材料，具有良好的生物相容性、低毒性等特点，制备简单，避免了免疫反应、感染以及伦理道德问题。其支架结构及丰富的生长因子在治疗创口愈合、加快组织的修复反应的同时，可以提高组织的修复的质量，在功能和美学上达到更好的效果。但是，PRF作为修复材料进行单独修复时疗效并不明显，此外，针对大面积的组织缺损，PRF会出现降解吸收过快、修复效果不理想等缺陷，目前临床上更多的是将其与其他生物材料联合使用进行治疗。PRF的制备方法已经十分成熟，针对PRF单独以及联合其他材料诱导组织修复、形成的具体机制还需要进一步深入研究，来为再生医学的发展应用奠定良好的基础。