不孕女性生殖道UU，CT，NG和MG感染状况分析及不同检测方法结果比较*

韩慕天，程洪波，王家雄，沈丽燕，王改改，宋　丹，杨慎敏，王馥新，许咏乐，王　玮，李　红，史轶超

(南京医科大学附属苏州医院生殖遗传中心，江苏苏州　215000)

生殖道感染对女性生育的影响一直受到大家的重视，但个别生殖道微生物对生育的影响还存在着争议[1]，如解脲支原体(ureaplasma urealyticum，UU)。随着分子生物学技术的飞速发展，检测方法也越来越精准。新技术的出现让我们能更快速和准确地检出各种生殖道病原体。流行病学研究表明，解脲支原体(UU)、沙眼衣原体(CT)、生殖支原体(MG)是非淋菌性尿道炎(NGU)最常见的病原体。其中UU的感染率为11%～26%，CT为11%～50%，MG为6%～50%[2]。UU是泌尿生殖道的常见微生物之一，因其可以分解尿素而得名[3]。目前，我国人群中UU的感染率日趋上升，由于反复感染以及抗生素滥用等原因，使之成为发病率较高的性传播疾病之一。UU感染后，患者多无明显症状，也易造成医生漏诊[4]。本文研究对象为不孕女性群体，旨在阐明该群体的生殖道微生物分布特征。随着分子生物学诊断技术的发展，生殖道病原体的检测经历由培养法、免疫法到核酸检测法多个阶段[5～7]。病原体分离培养法被认为是“金标准”方法[8]。然而分离培养操作复杂，所需时间较长和敏感度易受标本采集方式等影响，对临床常规检测和流行病学筛查带来了一定的困难。加之培养法取样采用拭子样本，该取样方式给病患带来一定的痛苦，尤其是男性患者，一些检测方法结果判定具有一定的主观性，容易引起假阳性和假阴性，给临床诊断带来一些困难。免疫学检测技术也得到了广泛的应用[9]，但由于质控困难，并且只能定性不能定量，加之有交叉抗原的存在[10]，故其应用得到了很大的限制。DNA检测技术有效地弥补上述不足，敏感度较高，其缺点在于不能进行药敏试验以及无法区分死亡和活动的病原体，故对于在治愈初期的病患，检测结果也可能是阳性[2]。故临床上急需建立一种灵敏、可靠的检测方法，以求能够准确检测出病原体。本研究运用核酸恒温扩增技术(Simultaneous amplification and testing，SAT)检测女性阴道分泌物中的UU，CT，MG和NG，并将其与培养法及乳胶法进行比较分析，现将结果报告如下。

1　材料与方法

1.1研究对象2016年6～9月于本院生殖中心门诊就诊的不孕女性患者467例，年龄20～48岁，平均年龄31.52±6.83岁。其中352例行辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)治疗。对照组选取105例已生育妇女体检拭子标本进行检测。采集标本之前1月内所有受试对象均未采取阴道灌洗、抗生素治疗等措施，并处于非月经期。本研究经医院伦理委员会允许，患者知情同意。

1.2试剂与仪器UU，CT，NG和MG核酸检测试剂盒(YZB/国3011- 2014)；MagX全自动核酸提取仪(上海仁度生物科技有限公司)；定量PCR仪(西安天隆科技有限公司)；UU培养鉴定药敏试剂盒(珠海丽珠生物科技有限公司)；CT，NG乳胶免疫层析法试剂盒(南京黎明生物制品有限公司)。

1.3标本采集用无菌棉拭子伸入女性宫颈口1～2 cm，旋转几周并停留数秒后取出，行ART的患者同时取两份拭子标本，分别用不同的方法进行检测。

1.4样本检测

1.4.1培养法(用于UU检测)：将采集的标本插入培养液中，挤压旋转三次，将培养液置于37℃温箱中培养48 h后观察结果，若培养液变为红色并清亮透明，即为阳性。不变色即为阴性。若培养液变红并伴有浑浊，则将培养液接种于10 mg/dl血平皿中，按照临床检验操作规程对微生物进行分离培养和鉴定。

1.4.2乳胶法(用于CT，NG检测)：将采集的标本插入生理盐水中，挤压旋转三次，即为待测样本。测试时，将待测样本滴入检测卡加样孔内，阳性标本在测试区(T)内会出现一条红色条带。阴性样本由于不含检测目的抗原，在测试区(T)内不能形成夹心复合物，故没有红色条带出现。

1.4.3SAT法：拭子标本取出后放入1 ml生理盐水充分浸泡后贴壁挤干，取0.5 ml与等体积的样本保存液混合，即为待测样本。使用MagX全自动核酸提取仪进行实验。首先，病原体被裂解释放出核酸，与核酸提取液中的相应磁性颗粒特异度结合，利用磁珠吸附纯化UU，CT，NG和MG的靶标RNA。加入42℃预热的SAT酶液，于PCR仪上扩增40个循环，荧光标记的优化探针与RNA拷贝特异性结合，产生的荧光由仪器进行检测。结果判断：dt表示样本曲线与阈值线交点的循环数，dt≤35的标本判为阳性。

1.5统计学分析应用SPSS 17.0软件对实验结果进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，两方法对比使用配对四格表χ2检验，当T<1时使用Fisher确切概率法分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1不孕女性生殖道UU，CT，NG和MG分布状况467例不孕女性生殖道拭子UU，CT，NG和MG经SAT法检测结果如下。其中UU阳性例数最多，阳性率62.53%(292/467)。CT阳性9例，阳性率1.93%(9/467)。NG阳性1例，阳性率0.21%(1/467)。MG阳性8例，阳性率1.71%(8/467)。与正常生育女性组23.81%(25/105)对比，不孕女性组UU感染率明显增高，差异具有统计学意义(χ2=52.01，P<0.01)。

2.2UU培养法和SAT检测结果阳性率比较选取其中352例受检女性进行UU拭子培养和SAT检测结果比较。SAT法检测UU阳性率为63.9%(225/352)，敏感度95.9%，特异度66.7%。培养法检测阳性率为48.9%(172/352)，敏感度73.3%，特异度94.5%，两样本经配对四格表χ2检验差异具有统计学意义(χ2=41.93，P<0.01)。其中60例样本拭子培养阴性而SAT法检测阳性，有7例样本培养法检测阳性SAT法检测阴性。

2.3CT乳胶法和SAT检测结果阳性率比较352例受检女性CT乳胶法检测结果。SAT法检测CT阳性例数为6例，阳性率1.7%(6/352)，敏感度100%，特异度98.6%。乳胶法检测阳性1例，阳性率0.3%(1/352)，敏感度16.7%，特异度100%，两样本经Fisher确切概率法统计分析，差异具有统计学意义(P<0.05)。NG两种检测法均无阳性检出，MG仅用SAT法检测未作比较。

3　讨论

UU是泌尿生殖道常见的一种共生微生物，其感染与多种疾病相关，包括非淋菌性尿道炎、宫颈炎、慢性前列腺炎、附睾炎以及不孕不育等[11，12]。CT是一类胞内寄生的微生物，能够感染男、女性泌尿生殖道[13]。在女性中能引起盆腔炎、宫颈炎、宫内感染等多种疾病[14]。然而在CT感染者中，约70%～80%的女性常常无明显的临床症状[15]，故可靠的实验室检测结果对疾病的诊断显得尤为重要。NG感染可导致一系列疾病，以宫颈炎和尿道炎最常见，并可进一步上行入侵引起睾丸炎、盆腔炎、输卵管炎，甚至扩散至全身引起广泛的炎症反应。淋病还可导致女性不孕、胎膜早破、异位妊娠和男性不育等病症，使临床检测和治疗面临着严峻的挑战[16]。MG不仅可以引起尿道炎和宫颈炎，并且近60%子宫内膜炎患者的宫颈黏液中能够检测出MG[17]。MG感染与子宫内膜炎和复发性盆腔炎有相关性[18]。值得一提的是，MG的检测仅限于核酸扩增试验。培养法所需时间过长，需要数月，并且敏感度不佳[19]。至今为止，血清学测定法和抗原检测等方法均不能应用于MG的检测。核酸扩增试验是MG唯一可行的诊断方法[20]。本研究结果显示，不孕症女性中UU感染率为62.53%，CT感染率为1.93%，NG感染率为0.21%，MG感染率为1.71%。UU是不孕女性生殖道检出率最高的微生物。显示UU和女性不孕症存在着密切的关系。值得注意的是，本研究中CT或MG阳性的患者中仅一例为UU阴性，其余均为并发感染，提示我们不同病原体感染之间可能存在着一定的关联性。

随着分子诊断技术的发展，病原体检测方法需要满足准确、高效和灵敏等要求。RNA检测技术因其特异、灵敏的优势广泛的用于生殖道病原体的检测。RNA检测技术包括SAT和转录介导扩增(transcription- mediated amplification，TMA)，这两种检测方法的扩增原理完全相同。由于病原体细胞中的RNA存在多个拷贝，故RNA检测技术相较于以DNA有更高的准确度，更重要的是只有活的病原体中存在完整RNA片段，故能排除治愈后已死亡病原体对检测结果的影响[2]。RNA具有易降解、不稳定的特性，使得该法交叉污染可能性更小，可以有效减少假阳性的产生，大大提高了检测结果的可靠性，有助于临床诊断的准确度和对疗效的监测[21，22]。此外，RNA检测结果还可以用于临床疗效监测，符合精准医疗的要求，是目前生殖道病原体检测的首选方法。本研究中泌尿生殖道感染患者的拭子样本，SAT法结果和培养法检测UU相比较，差异具有统计学意义，SAT法的阳性率更高，敏感度更强。这与郑渠等[23]报道的培养法与SAT法检测效能相当不同。SAT法与乳胶法检测CT结果相比，前者阳性率以及敏感度亦明显更高。基于SAT法可以以尿液检测的优势，兼具检测时间短、假阳性率低等优势，尤其当受检者正处于感染初期，病原体数量较少，DNA含量少，而RNA较多，SAT法对该类病人的检测具有独特的优势[24]，故该技术更适合作为体检检测方法进行人群筛选。然而由于SAT法敏感度强，容易被环境中的病原体或异物污染，故对实验室条件的要求更多，成本更高。此外，培养法可直接进行药敏试验，有助于指导临床用药，该法更适合作为筛选后的确诊方法。综上所述，SAT法和常规法联合检测UU，CT，NG和MG将为临床提供既准确又快捷的诊断依据。

综上所述，与其他方法比较，SAT法的优势更明显，如无创、操作简便、重复性好、敏感度高，并且一份标本可以进行多个项目的检测，避免多次取样之间的差异。更重要的是运用SAT法对病原体进行定量检测还可以应用到分子生物学研究、流行病学的统计与调查、疾病的早期诊断、分型与预后等多个方面为临床提供强有力的理论依据。

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