艾滋病治疗的研究进展

严延生 颜苹苹 陈亮 吴守丽 谢美榕 吴婷婷 夏品苍 邱月锋

2016年，估计全球累计约存活3800万HIV/AIDS病例，约有1900万例 HIV/AIDS病例接受抗病毒治疗并取得疗效，有效抑制了艾滋病的流行。但仍有半数HIV/AIDS病例不知自己的疾病状况或者无法治疗；且每天仍有5700例新发现感染者，已经成为全球的一个需要解决的紧迫问题。2014年7月，在澳大利亚墨尔本第20届全球艾滋病大会上，曾提出将治疗优先及治疗作为预防控制艾滋病的一种手段。2016年7月在南非德班召开的第21届全球艾滋病大会上，正式提出扩大艾滋病治疗并把其作为预防的一种策略（treatment as prevention），要求各国政府共同行动起来。此前，WHO根据联合国艾滋病规划署及相关部门的意见，已制定了2016—2021年加速实施艾滋病防控的3个90%策略，计划于2030年终止艾滋病、病毒性肝炎等传染病的流行。这些策略的提出，主要是基于HIV抗病毒治疗药物的有效性，使艾滋病成为一个可治疗、可管理的传染病。但不可否认的是，大多数中低收入国家要面对药物治疗所产生的重大经济负担问题，长期服药带来的药物副作用问题，停止药物治疗后病毒反弹等问题的产生，这对艾滋病的消除产生了巨大的影响。

1 分子治疗（molecular therapy）

1.1 CCR5基因突变治疗

CCR5是 HIV进入细胞最重要的辅助受体。如果CCR5发生突变，HIV就无法进入细胞，利用这种办法可以治疗艾滋病。全球唯一一例根除性治疗的成功病例是一德国人Timothy Ray Brown，他10年前就已被确诊为艾滋病，2009年入院治疗时是因为患上危及生命的粒细胞白血病。考虑到该病亦是由于艾滋病引发，因此异源造血干细胞的移殖进入其疗程，其结果该患者的免疫系统被整个取代。由于配型移殖的干细胞CD4T细胞的CCR5有一段32bp缺失，即发生 CCR5D32纯合子（delta32/delta32）的基因突变，该突变使HIV-1不能利用CCR5作为HIV侵入细胞的辅助受体而达到治疗目的。经这样的治疗，4年内该患者的血液、骨髓和直肠均不能检出HIV-1，这意味着该患者体内已完全清除了 HIV-1的感染。但一波士顿病人同样用带有野生型 CCR5基因突变的异源性的造血干细胞移殖，即使其周围血细胞只存在不到0.001%受感染细胞，也造成HIV病毒的反弹。也就是说，造血干细胞的移殖无法完全取代原来受感染的免疫系统。另外这种异源性的造血干细胞移殖的根除性治疗难度大，首先表现在难以找到可配对的供体；其次该法存在很高的死亡率和发病率，不适用于对生命威胁不大的多数病例，所以这种CCR5基因突变的根除性治疗方法难以推广使用。

1.2 细胞或病毒基因组的编辑治疗

锌指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFN）介导的特异性基因敲除或插入的研究约始于2004年，此后，这种技术已被广泛地应用于动物基因组的编辑修饰，一般认其为二代基因组编辑。

Tebas等从 Brown的治疗得到启发，利用自体同源CD4+T细胞敲除 CCR5这个主要辅助受体基因进行人体基因组编辑治疗艾滋病，此后，Li等则用该技术对成人造血干细胞敲除 CCR5进行艾滋病治疗的研究。在 Tebas等的研究中，共有12例接受HAART治疗并呈慢性无病毒血症的 HIV-1感染者被分为两个队列（每个队列6例，即cohort1和cohort 2），两个队列患者每例用100亿CD4 T细胞自体细胞输注，该细胞中含有约11%～18%用ZFN敲除去CCR5基因的细胞。ZFN修饰细胞的半衰期为 48周。其中cohort1在输注 4个星期后停止HAART治疗，第8周时病毒反弹至高峰，12周时病毒血症呈下降趋势，此后恢复治疗，总观察期252 d（36周），病毒血症均降至未能检出水平；此外cohort1组CD4 T细胞的比例也略高于未中断治疗队列，可见敲除去 CCR5基因对治疗艾滋病是有效的。但随着时间的推移，需防止嗜CXCR4病毒的发生。

近年来基因组编辑的技术方法有了很大的发展，尤其是 CRISPR/Cas9剪切编辑，现称其为第三代基因组编辑法。它与前述的锌指核酸酶的一个重要区别在于该法是对HIV前病毒的剪切消除，且近年已在各种动物的研究中取得令人满意的结果。

Yin等近期在美国分子治疗刊物上发表的第三代基因组编辑结果令人注目。该研究有4大特点：一是用可传导4条特异性向导RNAs（sgRNAs）和金黄色葡萄球菌核酸内切酶Cas9（sacas9）的多功能腺相关病毒（AAV）为载体，进行sgRNAs/saCas9AAV-DJ/8的基因组编辑，其敏感性、特异性效果要比只传导两条向导RNA的要好，在人源化的转基因鼠Tg26培养的神经干细胞或前体细胞中剪切整合的 HIV-1基因组实验中，未见脱靶（offtarget）现象；其次，在人源化的 Tg26小鼠中静注 sgRNAs/saCas9AAV-DJ/8可发生对HIV-1前基因组的剪切，在多个组织器官中显著减少了 HIV-1RNA的表达；第三，用 EcoHIV[系用鼠白血病病毒（murine leukemia virus，MLV）膜蛋白取代HIV的env膜蛋白构建的HIV-MLV嵌合病毒]急性攻击小鼠，随后静注sgRNAs/saCas9AAVDJ/8可显著的降低 EcoHIV的感染，用生物荧光显像法可确定sgRNAs/saCas9AAV-DJ/8在组织器官中剪除 EcoHIV的效果，PCR分型在试鼠的肝、肺、脑和脾的分型鉴定中也未能检出EcoHIV；第四，用骨髓、肝、胸腺（BLT）器官人源化的小鼠进行慢性 HIV-1的感染实验中，即使是单剂量的静注sgRNAs/saCas9 AAV-DJ/8，PCR分型鉴定也能成功的确定其有效的剪切了在脾、肺、心、结肠及脑组织中的前病毒，认为该法是进行人类临床试验前的重要步骤。

2 组合治疗（hybrid cure）

在使用现有ART后，HIV/AIDS病例中病毒载量大多可处于＜1000 copy以下，在治疗效果好的情况下，血浆中不能检出RNA，但一停药，储存库中潜伏的病毒就被激活反弹，组合治疗的目的在于缩小病毒储存库，降低病毒反弹的机率。剥离与消除（kick and kill）或激活与消除（shock and kill）这个混合治疗策略的提出具有3个明显的目标，其一要尽可能的减少HIV病毒潜伏储存的细胞，其二是要增强机体的免疫应答，以达到在ART治疗后对残存病毒储存细胞的免疫控制，避免停药后的病毒反弹。这种策略的实施，前提是 ART，其次用潜伏逆转剂 （latency reversing agents，LRAs）从药理学上激活潜伏的前病毒（kick or shock），第三是通过免疫清除或者通过 HIV-1蛋白表达的细胞病理效应来达到消除 HIV潜伏感染细胞的目的。至于所用的LRAs，需要通过临床治疗研究来确定其是否具有消除功能。增强机体的免疫应答，主要还是依赖研制具有广谱中和抗体（broadly neutral-lizing antibodies，bnAbs）和细胞毒 T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）的疫苗。

2.1 LRAs的组合

2.1.1 LRAs的临床研究当前HIV-1LRAs进行临床研究最主要的药剂是一组肿瘤细胞抑制剂，即组蛋白去乙酰化抑制物（histone deacetylase inhibitor，HDACi），如伏立诺他（vorinostat）、帕比司他（panobinostat）和罗米地辛（romidepsin）等。使用伏立诺他时，感染细胞的HIV-1RNA的表达不正常，虽然重复给药也难以确定血浆中HIV-1RNA的增加，但该药确有激活潜伏静息病毒的作用。HDACi可能比先前所认为具有更长的基因表达效应，随着HDACi治疗的施行，基因失调的时间延长，这种现象可能是由于CTLs功能障碍引起的。使用帕比司他和罗米地辛也同样显示细胞表达HIV-1RNA的失调，但与伏立诺他比较，重复给药后用转录介导扩增法（transcription-mediated amplification，TMA）或罗氏 COBAS AmpliPrep/TaqMan可检出这两种药血浆中增加了HIV-1RNA的表达，证实逆转剂的使用发挥逆转了潜伏病毒的功能。虽然双硫仑并非HDACi类药物，但也观察到血浆中的病毒血症和未剪切的 HIV-1RNA水平升高，具有相似LRAs的功能。

虽然上述 3种逆转剂的治疗效果得以肯定，但在表述时应该很谨慎，部分原因在于检测血浆中HIV-1RNA 的分析（TMA and AmpliPrep/TaqMan）不能与使用HDACi所产生的 CTLs攻击 HIV-1潜伏细胞后释放的病毒 RNA相区别。简而言之，是由于仪器的敏感性检出血浆中 HIV-1RNA还是使用HDACi的结果难以确定；另一个重要的原因是，在HDACi治疗后细胞HIV-1RNA的表达可能是所有有关转录的结果，而血浆中 HIV-1RNA的增加可能不单纯是HDACi治疗的结果，而又把它算在HDACi治疗的份上。如果是 HDACi治疗的结果，细胞HIV-1RNA转录的增加与HIV-1蛋白量的增加有关，只有检测HIV-1蛋白量增加与否，才能肯定是HDACi治疗的作用，因此，对逆转剂的使用需要认真评价。

2.1.2 新的 LRAs的体外评估LRAs临床试验的结果一般认为可以作为剥离与消除策略用于艾滋病的组合治疗。但HDACi的作用只是目前已知的前病毒潜伏机制逆转作用中的一种，前病毒潜伏机制复杂并呈多样性。用苔藓抑素 1或巨大戟醇衍生物通过蛋白激酶C（PKC）产生的 NF-kB的激动作用可使HDACi作为转录因子结合到 HIV-1的长末端重复序列上而发挥复制作用，可以认为是另一种逆转HIV复制的治疗方法，这个结果已由多个研究团队互为印证。LRAs单独使用一般是最有效的，但在苔藓抑素1或巨大戟醇结合的 HDACi情况下，这两种药至少存在协同作用。因此，对于新的LRAs的使用，评价时首先应保证HIV阳性感染者的健康安全。在动物试验中治疗指标不理想的所谓 LARs不能用于艾滋病治疗的临床研究。在临床用药前就必须确定 LARs效果以及在停药后是否能够启动bnAbs或CTLs的免疫应答。

2.2 疫苗的研制

组合治疗的另一要素即是bnAbs和细胞毒T细胞（CTLs）的免疫应答，这涉及到疫苗的研发。目前HIV/AIDS的治疗药物有6大类37种。药物治疗的有效性是公认的，但停药后，病毒的反弹也是明显的。长期服药后，不可否认用药者可出现副作用和体内耐药病毒的产生；此外，病毒反弹的结果与潜伏病毒库的大小密切相关。因此除了不断发展新型药物外，还需要研制有效安全的HIV疫苗，这类疫苗既可作为预防所需，也可作为治疗性疫苗使用。从功能学上说，有效安全的HIV疫苗不外乎必须具备体液免疫和细胞免疫两个主要功能，即前者需要产生bnAbs，而对于治疗性疫苗而言，后者需产生CTLs。因为，CTLs必须在各组织器官中巡航，以寻找潜伏病毒库。

从 1987到2013年，迄今已有27年的历史共有6种疫苗投入试验，除在泰国进行的RV144疫苗的现场试验取得一些成效外，其他均以失败告终。主要原因是对HIV本身的特征和生命循环的了解还有欠缺，包括其早期整合入人体基因组、病毒的高度糖基化及致密性、唯一产生中和抗体的包膜（env）刺突序列易变的特性等基础研究不足，导致研制的疫苗无法进入实用，疫苗的这些问题，虽然在动物研究或实验室研究都有成功的范例，但在人类应用方面还存在问题。

2.2.1 艾滋病疫苗的杀伤性或CTLs的产生使用RV144时，已经考虑了疫苗的细胞免疫问题，所采用的程序为初免及加强免疫。初免时使用3个表达HIV env，gag和pro基因的金丝雀痘载体疫苗，加强免疫时用含HIV-1B/E亚型重组gp120糖蛋白，但在 42个月内也只有约31.2%的有效性，为何未达到期望的效果，应当引起认真的反思。大量的动物研究也给我们另一些有益启示。第一，ADCC以及其他非中和功能但又携带免疫功能细胞的Fc段受体（FcR）可能可抗HIV传播。因此要加强对疫苗使用新的佐剂的研究，佐剂对CTLs的生成具有重要作用；第二，CTLs可以通过杀伤HIV感染的CD4 T细胞控制病毒载量，用可克服病毒易变性多基因嵌入的“马赛克”疫苗的初免和加强策略可以大幅度提升人类的 CTLs细胞识别HIV的水平，这个研究成果已在模仿人感染的动物试验研究中得到证实；第三，用SIV gag插入到减毒的恒河猴巨细胞病毒载体（rhCMV）上具有很明显的免疫效果，此类疫苗接种后首轮感染 HIV就可见 50%的清除病毒的结果；有意思的是，rhCMV可以大幅度地诱导产生CTLs，而且识别抗原的非典型CD8 CTLs细胞介导了HIV感染靶向细胞的杀伤，但这种在非人灵长类的研究是否适用于人类临床试验，目前仍没有答案。

2.2.2 bnAbs的产生艾滋病疫苗的另一个重要关注点在于bnAbs，因为 bnAbs应对全球不同的分离株都必需起中和作用才有意义。从 2009年始，已大规模开展了对 HIV感染者 bnAbs的分离分析研究；其次，对 env刺突进行高分辨率结构的分析；第三，是在分子水平上研究bnAbs如何与 env进行结合，其目的在于设计新的免疫原；第四，探究 bnAbs在体内如何与感染者共进化；第五，研究机体如何限制bnAbs的产生；第六，奠基者病毒（TF）传播扩散的特征；第七，用奠基者病毒包膜研制嵌合的人—猴免疫缺陷病毒（SHIVs），这个研究虽有一定难度，但已被克服。当猴用 SHIVs攻击时，被动给予试验组猴bnAbs也可以阻断SHIVs的传播，这就提示bnAbs在抗HIV感染传播的重要性，但目前的疫苗无法诱导机体产生高效价的bnAbs。

诱导 bnAbs的产生的因素是多方面的。首先，免疫原应该具有精确的能产生bnAbs的env表位结构，目前从自然分离的HIV中基本上难以获得这种免疫原，人工设计免疫原是主要途径。这种人工设计优化的免疫原应当能产生bnAbs，而且抗原抗体关系在分子层面上要能解释清楚。在实验室中可获得可溶性gp140这样的env衍生物，gp140病毒三聚体（SOSIP）的结构可被结晶化和低温电镜（cryo-EM）所见，结晶化结构和低温电镜结构应当显示它们是一致的，都是膜结合三聚体结构，这个分析很重要。SOSIP三聚体只有在这样一致的状况才可诱导产生有效的、高效价的bnAbs。遗憾的是，单独用实验室提取的SOSIP三聚体免疫兔和猴并不能诱导产生bnAbs，其在提取过程中结构发生了变化，这就是说，在免疫动物前，两结构没有互为比对的结果，SOSIP产生这样的变构，gp120也是难免的。另外，bnAbs可以与感染的病毒共进化，这就提示最好要用多种人工设计的 env免疫原来诱导 bnAbs的产生。

产生 bnAbs另一个难以逾越的障碍是env的糖蛋白抗原性。env是目前已知天然蛋白中糖基化程度最高的蛋白之一，其被 bnAbs结合的保守位点为多糖遮盖包埋。因此，有效的bnAbs必须能与多糖反应，最起码 bnAbs中必须含有与多糖反应并揭开多糖能力的组分。很遗憾的是，env多糖往往是从宿主来的，换句话说，它不是异源的东西，所以它的免疫源性很弱，因此在设计免疫原时应考虑这一问题。

目前已知 env刺突顶部多肽位点有利于启动对自然感染的抗体反应，通常反应也比较早，且只发生较低的体细胞突变。然而，这种形式生成的抗体需要对多糖的识别，虽然这种多糖比较单纯，主要是甘露聚糖。bnAbs识别包膜糖蛋白41（gp41）-gp120结合界面通常涉及复杂的异构的多糖，因此这类疫苗可能没有优势。在决定最佳的bnAbs结合位点方面，实验研究很重要。

2.3 疫苗研制的策略

上述所言，已经界定了保护性疫苗的基本原则，因此HIV疫苗研发的关键问题包括：1）已知RV144有一定的抗感染能力，所以应加强对新RV144再试验的研究，特别是在使用新型佐剂方面要加以考虑；2）应当逐步过渡到人体临床试验来确定什么样的减毒 CMV或其他载体能够类似猴 CMV载体诱导非典型的CD8 T细胞清除急性HIV的感染的研究；3）应当确定用于诱导bnAbs的env免疫原最佳结构、形态和序列。以上 3点原则，是研发实用艾滋病毒疫苗的关键所在。

3 发现潜伏感染病毒细胞的标记

现已认识到，HIV感染者中持续存在的潜伏病毒库是HIV治疗一大障碍。近期，Descours等发现了一个新的潜伏感染病毒细胞的标记。在HIV潜伏感染的CD4 T细胞的体外模型中，发现了 103个上调基因表达识别标记，包括了16个跨膜蛋白基因，而这些基因均是从潜伏感染的细胞表达的，也可以说极具特异性。在这些潜伏感染的CD4 T细胞的体外筛选中发现他们表达低亲和力受体的免疫球蛋白IgG Fc片段CD32A，并呈高度诱导表达，但在非潜伏感染的CD4 T细胞中不表达，这就提供了区别潜伏感染与非潜伏感染的 CD4 T细胞的重要标记。值得注意的是，CD32A表达产生与常规经T细胞受体感染HIV的途径无关，提示CD32A产生是依赖于细胞潜伏感染的另一机制。在抗逆转录病毒治疗有效的 HIV-1感染者血液样本中，发现可表达CD32A的细胞约占 CD4 T细胞亚群的0.012%，每个细胞约携有 3个拷贝的 HIVDNA。此外，在某些受试者中，具有CD32A标记的细胞还占主导地位，这与这些受试者具有的CD32A标记的细胞富含可诱导具有复制能力的病毒有关。研究证实带有CD32A标记淋巴细胞可以代表难以找到的潜伏感染的HIV-1储藏库，这将促进靶向研究来消除具有这一表面标记的潜伏病毒储藏库。

4 展望

已有的治疗药物已构成了全球艾滋病的治疗体系，目前新的药物仍在不断申报研制中，因此，WHO的3个90%的目标如果能够实现，那在 2030年全球消除艾滋病的愿景可能能实现。本综述在ART的前提下，分别就分子治疗、组合治疗及与治疗有关的潜伏期感染病毒细胞的标记进行了简述，无论是目前的药物治疗、还是基因组编辑治疗等，都无法治愈艾滋病，归结到一点，其主要原因均在于存在着潜伏病毒储藏库，一旦治疗停止，病毒繁殖反弹；而终身服药治疗，难免存在药物副作用及耐药病毒产生等问题，所以在有效治疗后，如何控制病毒的反弹是一个永恒的话题。因此，努力寻找新的潜伏感染的HIV-1储藏库及其标记物，研究控制缩小潜伏感染的储藏库药物和方法，这是目前艾滋病治疗方面最大难点。使用载体的分子治疗，其对人体健康安全的长远评估难以预测；使用LRAs的HDACi也是一种化疗的方式，同样，这些治疗都难以达到治愈目的。因此，除继续加强对上述治疗的技术方法进行研究测试外，研制可产生广谱中和抗体及CTLs疫苗进行控制及监视潜伏病毒的细胞，不因病毒反弹而使免疫系统再次受打击，这才是安全有效可接受的长期艾滋病的管控办法。