白念珠菌毒力因子及致病机制研究进展

陆一纶 吴岚 唐若愚 姜远英 曹永兵,4

(1.第二军医大学学员旅学员11队，上海 200433；2.第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433；3.同济大学医学院，上海 210110；4.上海市中西医结合医院上海市中西医结合脉管病研究所，上海 200082)

白念珠菌为条件致病性真菌，具有酵母-菌丝双相型。在正常情况下，白念珠菌作为无害的共生体驻留在大多数人身上。当机体的稳态被破坏，白念珠菌可引起从皮肤的浅表感染到危及生命的全身性感染在内的各种真菌病。白念珠菌存在于约75%的人体口腔内,常发生口腔内感染，称为“口腔念珠菌病”(oral candidiasis,OC)[1-2]。约75%妇女一生中至少患有1次外阴阴道念珠菌病 (vulvovaginal candidiasis,VVC)[3-4]。易感人群，移植患者，低体重新生儿及接受放化疗的患者更容易因为口腔或阴道黏膜感染念珠菌而发展成黏膜和全身等严重感染，如口腔炎，阴道炎，血液感染及深部组织感染[5]，其中念珠菌血症最为常见[6]。全身性念珠菌病死亡率仍然很高[7]。由于白念珠菌在临床上引起的危害，对其致病机制以及宿主抵御能力的研究具有重要意义。

真菌细胞的内在特性及对一些外界因素的响应能力已被证实对真菌致病性有一定作用，迄今为止，白念珠菌为条件性致病真菌，其致病机制尚不明确，目前认为白念珠菌感染在不同宿主的感染力受到多种毒力因子和宿主的影响，如酵母菌丝转换、调解黏附性分子的分泌及对宿主细胞的入侵、分泌水解酶类、生物膜的形成、联系传感和向触性等[8]。此外，其他影响因素还包括快速适应环境pH值的波动，代谢调整的灵活性，营养采集系统转换和应激性反应等[9]。在过去几年中，随着研究的深入，人们对这些因素和机制在白念珠菌感染中所发挥的作用有了更多的认识[10]。故本文对白念珠菌毒力因子的致病机制及毒力研究所涉及的几个方面进行综述。

1 多态性

白念珠菌的多态性是其主要毒力因子之一。白念珠菌是一种多态真菌，可以在酵母态，假菌丝态和菌丝态三种细胞形态之间相互转换，并可以相互交织存在，形成具有三维立体结构的生物被膜[11]。菌丝形式已被证明比酵母形式更具侵略性。白念珠菌形态可因受到环境因素影响[12]及群体感应而转换，高细胞密度 (>107cell/mL)可促进酵母态细胞的生长，而低细胞密度 (<107cell/mL)则有利于菌丝态细胞的形成。酵母与菌丝生长形态的转换学术上被称为同种二形性，与真菌的致病性密切相关，一旦形成菌丝，其相关的毒力因子也会随之大量表达，从而提高其致病性[13]。研究表明，菌丝态白念珠菌可以通过释放水解酶来侵袭宿主的上皮细胞和内皮细胞，进而造成系统性真菌感染。菌丝除了可以帮助其逃逸被吞噬细胞的吞噬，还可以通过穿透上皮表面而到达更深的组织[14]。

2 黏附素和侵袭素

白念珠菌侵袭人体时，菌丝表面黏附素 (Hwp1p)和侵袭素 (Als3p、Ssa1p)会与宿主上皮细胞的相应受体结合，促进黏附；同时，菌丝尖端分泌水解酶 (Sap2)和溶解素 (Candidalysin)，侵袭和破坏宿主上皮细胞膜的完整性，使细胞膜通透性增加，减弱宿主细胞的防御能力[15]。白念珠菌通过两个不同的机制来侵入宿主细胞:诱导性内吞作用和积极渗透。诱导性内吞作用是指真菌表达细胞表面的特殊蛋白-侵袭素,结合到宿主配体，如上皮细胞的E-钙黏素和内皮细胞的N-钙黏素上，从而诱导被吞没的真菌细胞进入宿主细胞[16-17]。即使是被灭活的菌丝，其诱导内吞作用仍存在。说明这是一个被动的过程,不需要真菌细胞的活动。目前，两个侵袭素已确定，即Als3和Ssa1。Ssa1是一种细胞表面表达的热休克蛋白70 (Hsp70)家族的成员。als3Δ/Δ和ssa1Δ/Δ突变体会减少上皮细胞黏附素和侵袭素的表达，可降低小鼠口咽念珠菌病模型中白念珠菌的毒性。Als3和Ssa1可结合到宿主的钙黏蛋白，这可能诱导宿主细胞对白念珠菌的内吞作用。相比之下,积极渗透是真菌侵染宿主细胞的一个主动反应过程，需要真正的白念珠菌菌丝。

白念珠菌有一系列特殊蛋白-黏附素，可调节白念珠菌之间及与其他微生物、非微生物、宿主间的黏附力[18]。在生物被膜形成的早期，白念珠菌需要黏附在非生物介质的表面，该过程主要依赖于细胞表面的黏附相关蛋白。其中包括凝集素 (Als)家族中的凝集素样序列蛋白Als3、Als5以及菌丝细胞壁蛋白Hwp1、分泌天冬氨酸蛋白酶Sap4、Sap5、Sap6和菌丝相关蛋白Ece1和Hyr1等。白念珠菌黏附素最好的研究模型是凝集素样序列 (agglutinin-like sequence,ALS)蛋白，其家族包括Als1-7及Als9。ALS基因编码糖基磷脂酰肌醇 (glycosylphosphatidylinositol,GPI)样细胞表面糖蛋白，其中Als3对黏附素尤为重要[19]。上述毒力因子相关的编码基因表达与菌丝形成有关，但毒力因子本身不参与菌丝的形成[20]。在体外口腔上皮细胞与白念珠菌共孵育，以及体内阴道感染白念珠菌期间，均可观察到白念珠菌ALS3基因表达上调[21]。研究表明，念珠菌口腔与上皮细胞混合培养，其菌株中均可检测到ALS2及ALS3mRNA的表达[22]。并且ALS在不同的模型中表达有所差异，但表达方式无明显菌株差异[23]。另一个重要的白念菌黏附素是Hwp1，与菌丝相关GPI样蛋白有关。Hwp1是哺乳动物转谷氨酰胺酶的底物，可能通过共价链接结合白念珠菌菌丝与宿主细胞，从而引起白念珠菌感染[24]。研究发现，Hwp1和Als3也与白念珠菌生物膜的形成有关。独立形态蛋白质 (independent morphogenetic proteins)也可以促进细胞黏连，包括GPI连接蛋白Eap1、Iff4和Ecm33，非共价壁相关蛋白Mp65 (β-葡聚糖酶)、Phr1 (β-1,3葡聚糖转移酶)，细胞表面相关蛋白酶Sap9、Sap10，以及蛋白质Int1整合蛋白样表面蛋白。

目前仍不清楚入侵宿主细胞第二线路的调节机制有哪些，但真菌黏附素和物理阻力 (physical resistance)被认为是至关重要的。天冬氨酸蛋白酶 (Saps)似乎也与积极渗透相关，但脂肪酶和磷脂酶未被证实有助于这一过程。因此，白念珠菌侵袭宿主细胞可能是由互相补充的两种机制引起的：由Als3和Ssa1诱导的内吞作用以及目前机制仍不明确的积极渗透作用。

3 分泌水解酶

随着白念珠菌黏附到宿主细胞表面，并生长出菌丝，白念珠菌菌丝便会分泌水解酶，以促进白念珠菌通过内吞作用 (类似肠致病性细菌的特许细胞)及积极渗透 (类似植物真菌致病原理)完成主动渗透[25]。此外，分泌水解酶还可提高细胞外营养获取的效率。白念珠菌分泌水解酶分为三种类型：蛋白酶、磷脂酶、脂酶。

天冬氨酸分泌蛋白酶家族 (Saps)由十名成员Sap1-10组成。Sap1-8分泌和释放到周围介质，而Sap9和Sap10可结合到细胞表面[26]。在全身感染小鼠模型中，Sap1-3已被证实可参与损害重组人类上皮[27]。最新的研究表明，Saps在白念珠菌的不同致病阶段都发挥重要作用，包括黏附、浸润、上皮损伤和免疫逃避等。体外实验证实破坏编码Saps的基因会降低白念珠菌损伤阴道和口腔上皮细胞的能力，从而减少宿主感染[28]。

磷脂酶家族由A、B、C、D四类磷脂酶构成[29]。其中B类磷脂酶第5名成员PLB1-5位于细胞外，其通过破坏宿主细胞膜，可提高其致病性。在全身感染小鼠模型中，plb1Δ/Δ和plb5Δ/Δ突变已被证明可使白念珠菌毒性减弱[30]。

脂酶由LIP1-LIP10等10名成员组成。lip8Δ/Δ突变也可降低白念珠菌在全身感染小鼠模型中的毒性，证实了胞外水解酶在白念珠菌致病性中的作用[31]。

4 生物膜形成

生物膜形成是一个连续的过程，包括酵母细胞黏附到基底物，酵母细胞增殖，生物膜上菌丝细胞成形、细胞外基质材料的积累，以及酵母细胞最终从生物膜播散[32]。导管、假牙 (非生物)和黏膜细胞表面 (生物)是最常见的依附底物[33]。与浮游细胞比较，成熟的生物膜对抗菌药和宿主免疫系统有更强的抵抗力[34]。其影响因素包括结构复杂的生物膜、生物膜基质、药物外排泵 (drug efflux pumps)的表达增加及代谢可塑性 (Metabolic plasticity)的增强。成熟生物膜的酵母细胞播散已被证实有直接毒力作用，播散细胞在感染小鼠模型中的毒力更强[35]。Hsp90是一种负责各种宿主蛋白稳定性的热休克蛋白，其通过稳定蛋白磷酸酶钙调磷酸酶和MAPK Mkc1，在蜉蝣状态下，产生并维持白念珠菌生物膜的耐药性。Hsp90亦可以通过抑制cAMP-PKA信号来调节与温度相关的白念珠菌的形态变化。此外，Hsp90亦是生物膜对抗真菌药物产生抗性所必需的。

转录因子Bcr1，Tec1，Efg1可控制生物膜的形成[36]。Nobile 等研究转录网络对生物膜形成的调节以及生物膜生产调节器,其影响因素包括Ndt80 Rob1和Brg1。已有研究表明，BCR1，TEC1，EFG1，NDT80，ROB1及Brg1中任何一个调节因子的删失，都会导致活鼠感染模型中白念珠菌生物膜形成的缺陷[37]。

细胞外基质的产生由另外的因素控制。锌反应性转录因子Zap1可负调节生物膜基质的主要成分β-1,3葡聚糖。葡萄糖淀粉酶Gca1和Gca2，葡聚糖转移酶Bgl2和Phr1，以及外切葡聚糖酶Xog1是β-1,3葡聚糖的正调节器。虽然GCA1和GCA2的表达受Zap1控制，但酶Bgl2、Phr1和Xog1可不依赖Zap1起调节作用。缺乏BGL2、PHR1或XOG1的生物膜在体外和体内均对氟康唑更敏感。此外，最近的研究表明，白念珠菌生物膜对中性粒细胞的杀伤具有抵抗性，且不引发活性氧 (ROS)产物。有实验证据表明，细胞外基质中的β-1,3-葡聚糖可以结合更多的氟康唑，降低其对抗真菌药物的敏感性[38]。

5 传感和向触性

低氧、缺乏营养及渗透压增高等环境因素对真菌生长具有非常重要影响，接触传感也是一个重要的环境信号。真菌通过与物质表面接触了解周围环境情况，并可触发菌丝以及白念珠菌生物膜的形成。白念珠菌的传感性同时会导致侵入性菌丝的形成，这些菌丝穿透并在基础材料内生长，其可以是宿主组织或实验室培养基。在宿主内，穿透性菌丝可到达血流，成为全身系统性感染的传播基础。

向触性是指人类致病真菌如白念珠菌重新定位菌丝长轴以适应潜在的表面形貌。在某些具有特定拓扑表面的基质上 (如脊线)，可能会发生定向菌丝的生长。Brand等人研究发现，白念珠菌菌丝向触性是由细胞外钙吸收的钙通道Cch1、Mid1和Fig1调节的[39]。其他调节机制还包括Rsr1极体/Bud1-GT酶[40]。实验室中可以检测白念珠菌的向触性反应，例如在人造物表面或者含有脊结果，白念珠菌附着胞生长可被诱导、重新取向。MS通道可被钆剂抑制，经过Gd3+处理菌丝生长而被抑制，表明白念珠菌MS通道会影响菌丝的向触性。与此观点一致的研究结果是，编码白念珠菌MS通道成分的MID1基因的缺失，可导致其向触性的降低 (在脊处重新定向的能力)。

6 小 结

理解白念珠菌的致病机制对发展新型抗真菌药物、诊断疾病至关重要。经典的抑菌及抗真菌药物旨在杀死病原微生物。然而，专门针对毒性因素治疗方案已被建议作为一个新的和有前途的抗真菌策略。一些毒力因素，如多态性、蛋白酶的分泌、侵袭素的表达,被认为是有研究价值的目标。因此深入研究白念菌致病机制和感染宿主的相关分子机制可为白念珠菌及其他病原微生物发病机制的研究、临床诊断和治疗提供依据。

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