H2O2对白及多糖脱色工艺研究

车向前，常明泉，陈 芳，江蓉敬

0 引言

白及是兰科植物白及属[Bletilla striata(thhunb.)reicheb.f.]多年生草本植物的地下干燥块茎，味苦甘涩,性微寒，富含白及多糖,已证实具有药理作用的成分有联苯类、菲类、萜类[1-4]。白及中的活性成分对葡萄球菌及链球菌有抑菌作用，可在局部形成保护膜，能控制及防止胃部感染；白及多糖能显著缩短凝血时间，加速红细胞的沉降率，使红细胞凝集，形成人工血栓，从而修复血管缺损，达到止血的作用；白及具有收敛止血、消肿生肌的作用，可治疗生疮出血、咳血，收敛肺气。目前，研究白及提取工艺的报道较多，而其脱色工艺的研究目前未见报道，脱色后的白及多糖产品市场上也未见供应。传统的白及多糖提取方法为水提醇沉法，对其纯化常见的有丙酮-乙醇交替洗脱法，该法由于耗时、耗费大量试剂，成本高，且会有一些试剂残留，对治疗或食用带来安全隐患。由于白及提取过程中有大量植物色素存在，难以获得较纯的白及多糖，且影响后续成分研究，对于将白及提取物用于化妆品、食品而言，其色素的存在影响制成品的品质[5]。笔者探讨使用H2O2脱除白及多糖中的植物色素，获得较纯的白及多糖原料，以拓展白及的应用领域，提升后续开发产品的质量。

1 仪器与材料

TU1901型双光束紫外/可见分光光度计(北京普析通仪器有限责任公司)；DHG-9023A型鼓风干燥烘箱(天津市顺诺仪器科技有限公司，300×300×270)；FA 2004分析天平(天津天才精密仪器厂，精度：0.000 1 g)；WGA-UNI-10型超纯水器(功率：300 W，北京普析通仪器有限责任公司)；无水葡糖糖对照品(中国食品药品检定研究院提供，批号：17-03134-01，纯度：99.941%)；白及(湖北神农本草公司，经湖北医药学院附属医院叶立红教授鉴定为兰科植物白及)；30% H2O2(黑龙江惠美佳制药有限公司，批号：20151130)；蒽酮(上海叶缘生物有限公司，批号：20150222)；SSW型电热恒温水浴槽(上海博讯实业有限公司医疗器械厂,700 W)；纯化水(湖北医药学院附属太和医院新鲜制备)，盐酸、氢氧化钠为分析纯。

2 方法与结果

2.1 白及多糖提取液的制备 取白及饮片置60 ℃烘箱中烘干，粉碎，过10目筛，取该粉末50 g加纯化水(药液比1∶15) 750 mL浸泡60 min,煎煮提取60 min,过滤，收集滤液，药渣加纯化水(药液比1∶10)500 mL，煎煮提取90 min，过滤，集中滤液，药渣加纯化水(药液比1∶5)250 min，煎煮提取90 min，过滤，集中滤液，加纯化水稀释至2 000 mL，用蒽酮-硫酸法测定多糖含量使成2.00%(mg/mL)，备用。

2.2 脱色率的测定[6]用紫外分光光度计在473 nm波长处测定脱色前后提取液的吸光度值，计算脱色率。脱色率(%)=(A前-A后)/A前×100%。A前为脱色前提取液的吸光度值，A后为脱色后提取液的吸光度值。

2.3 多糖保留率的测定[7-8]精密称取在105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品适量，加纯化水溶解制备成0.051 5 mg/mL的对照品溶液，取脱色后的提取液稀释至一定浓度，用蒽酮-硫酸法在620 nm处测定吸收度，计算多糖的含量，多糖保留率(%)=M后/M前×100%。M前为脱色前提取液中多糖的含量，M后为脱色后提取液中多糖的含量。

2.4 H2O2脱色影响因素的考察 分别考察H2O2体积分数、脱色温度、脱色时间，以及pH值对脱色率、多糖保留率的影响，每个因素设置5个水平。

2.4.1 H2O2体积分数 取白及多糖提取液50 mL于100 mL三角烧瓶中，共15份，每3份1组，1～5组依次按2%、4%、6%、8%、10%体积分数加入H2O2，混合均匀，调pH值至8，脱色90 min后移至50 ℃水浴中继续搅拌脱色30 min,取出，过滤，取续滤液测定脱色率和多糖保留率，结果见图1、表1。

2.4.2 温度 取白及多糖提取液50 mL于100 mL三角烧瓶中，共15份，每3份1组，各组分别按体积分数6%加入H2O2，混匀，调pH值至8，1～5组分别在30、40、50、60、70 ℃中脱色120 min，取出，过滤，取续滤液测定脱色率和多糖保留率，结果见图2、表1。

图1 H2O2体积分数影响因素

水平因素体积分数(A,%)温度(B,℃)时间(C,h)pH值(D)1430606264090738501208

图2 温度影响因素

2.4.3 时间 取白及多糖提取液50 mL于100 mL三角烧瓶中，共15份，每3份1组，每份均按体积分数6%加入H2O2，混匀，调pH值至8，1～5组样品分别于50 ℃水浴中脱色30、60、90、120、180 min，取出，过滤，取续滤液测定脱色率和多糖保留率，结果见图3、表1。

图3 时间影响因素

2.4.4 pH值 取白及多糖提取液50 mL于100 mL三角烧瓶中，共15份，每组3份，每份分别按体积分数6%加入H2O2，混匀，1～5组分别调pH值为5、6、7、8、9，然后于50 ℃水浴温度中脱色120 min，取出，过滤，取续滤液测定脱色率和多糖保留率，结果见图4、表1。

图4 pH值影响因素

2.4.5 工艺优选 根据以上单因素试验结果，应用L9(34)进行四因素三水平的正交设计实验，确定H2O2对白及多糖的最佳脱色工艺，见表2。以脱色率、多糖保留率为考察指标，实验数据采用加权平均法，实验所得各项指标除以该列最大值，乘以100，为该项得分，对于白及多糖的脱色，首先考虑脱色率，其次是多糖保留率，因而设定脱色率(X)和多糖保留率(Y)的权重系数均为0.5，对2项指标进行加权求和，即H=0.5 X+0.5 Y，得到综合评分，见表3。从表3看出，综合色素脱除率和多糖保留率两个因素，H2O2用于白及多糖脱色影响因素大小依次为A>B>D>C，其中A因素及B因素中各水平间差异有统计学意义。确定最佳脱色条件为A2B3D2C2。

2.4.6 验证试验 根据上述试验结果，为了验证工艺的可靠性，取同一批次白及多糖提取液，加入体积分数为6%的H2O2，将pH值调至7，在50 ℃下脱色90 min,取出，过滤，测定脱色率和多糖保留率，结果脱色率为66.80%，预测试验脱色率为68.53%，对验证试验与预测试验的脱色率进行比较，结果RSD为1.81%；验证试验多糖保留率为68.60%，预测试验多糖保留率为67.11%，对验证试验与预测试验的多糖保留率进行比较，结果RSD为1.55%。

3 讨论

白及多糖中如果存在结合性色素则难以脱除，白及多糖提取液是弱酸性的，将提取液pH值调至弱碱性，可促使植物色素细胞破壁，破坏与多糖的结合形态，有利于多糖与色素的分离，从而增强脱色效果。H2O2是一种氧化剂，通过氧化色素使白及多糖脱色[9-11]，H2O2的体积分数是影响脱色效果的重要因素，在本实验中，当体积分数在6%～10%区间时，脱色率趋于稳定，而多糖保留率则随着体积分数的增加出现降低趋势，这是因为H2O2在氧化色素的同时也氧化多糖，使糖的结构发生改变、分解，使多糖损失率增多甚至部分失去活性[12]。在最佳脱色效果、最少多糖损失中探索平衡点，合理掌握H2O2用量。实验结果显示，用H2O2脱色速度快，处理样品量大，所加入的H2O2在适宜的温度和时间下可去除,其残留量远低于相关规定的限量[13]。活性炭是传统的脱色剂，脱色效果良好，但脱色后活性炭残留难以完全去除，影响成品外观。该结果低于文献报道的应用活性炭对荔枝多糖的脱色率(93.46%)[14]，与其多糖保留率68.61%的结果基本吻合，与秦亚东等[15]报道的用粉末活性炭对白芍多糖脱色率65.00%、多糖保留率69.86%接近。实际生产中，脱色率和多糖保留率指标需根据应用目的选择，对于本实验结果而言，脱色率达到60%以上即符合生产需要，在此前提下需尽量多地保留多糖。对于来源于植物的多糖，常含有酚类、羟基蒽醌衍生物等，这类色素大多呈负性离子，用活性炭脱色的效果不好，而与糖形成结合型色素用H2O2脱色效果可能优于活性炭。

表2 L9(34)H2O2脱色正交实验结果

表3 脱色效果方差分析表

在水浴适当温度(50 ℃)下有利于多糖的溶解，降低黏性，增加与色素的分离，在适宜温度中脱色有助于残留H2O2的挥尽，避免影响多糖的含量测定。本实验结果表明，时间对脱色率与多糖保留率在30～60 min之间有明显变化，60 min是脱色的临界时间，在90～180 min之间两者都趋于稳定。本实验中，体积分数、pH值是影响脱色效果的主要因素，温度和时间因素次之。用H2O2对白及多糖脱色的最佳工艺为：体积分数6%，pH 7，温度50 ℃，脱色时间90 min。应用该工艺能使白及多糖获得最佳的脱色效果。

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