基于EST—SSR标记的云南大叶茶资源遗传多样性分析

尚卫琼+段志芬+杨毅坚+李友勇+成浩+刘杰+杨兴荣+杨盛美+矣兵+刘本英+毕晓清

摘要：丰富的遗传变异对提高作物的环境适应性和加快遗传改良进度至关重要。为进一步了解云南大叶茶种质资源的遗传多样性，利用28对SSR引物对94份大叶茶种质材料进行遗传多样性分析，结果共检测到等位基因128个，平均每个位点为4.57个；Shannon信息指数（I）在0.91～1.66之间，最小为5087位点0.91，最大为1696位点1.66，平均每个位点为1.30；多态性信息含量（PIC）数值在0.476～0.753之间，最小为5087位点0.476，最大为1696位点0.753，平均值为0.64；平均观测杂合度和平均期望杂合度分别为0.71、0.70。通过对94份供试材料来源地遗传分化分析和聚类分析表明，材料的遗传变异主要存在于不同来源地之间而非同一来源地内。并且多数同一来源的材料分散在不同类群中，材料来源地间遗传距离与地理距离不存在显著的相关性。研究认为，聚类结果与多态性信息含量等参数值分析结果一致，表现出丰富的遗传多样性。这可为云南茶树资源的育种和创新利用提供研究基础。

关键词：云南；大叶茶 ； EST-SSR；分子标记

中图分类号：S571.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）01-0016-07

Abstract Abundant genetic variation is very important for improving environmental adaptability and genetic improvement of crop. In order to know the genetic diversity of Daye tea germplasm resources in Yunnan， 94 tea germplasms were selected for the analysis using 28 pairs of SSR primers.A total of 128 distinctive loci were detected with the mean as 4.57； the Shannons information index （I） ranged from 0.91 to 1.66 with the mean as 1.30， and 0.91 and 1.66 were in the loci 5087 and 1969 respectively； the polymorphism information content （PIC） ranged from 0.476 to 0.753 with the mean as 0.64，and 0.476 and 0.753 were also in the loci 5087 and 1696 respectively； the average observed heterozygosity and the average expected heterozygosity were 0.71 and 0.70 respectively. The results of genetic differentiation analysis and cluster analysis for the source areas of 94 tea germplasms showed that genetic variation mainly existed between the germplasms from different source areas but not from the same source area， and most germplasms from the same source area distributed in different groups；there was no significant correlation between the genetic distance and the geographical distance. It was concluded that the cluster analysis and the analysis of PIC had the same results， which showed abundant genetic diversity. These results could provide research foundations for breeding， innovation and utilization of Yunnan tea germplasms.

Keywords Yunnan； Daye tea； EST-SSR； Molecular marker

茶樹种质资源是茶树育种、遗传研究和生产利用的物质基础。云南具有十分丰富和多样化的生物种质资源，还是世界茶树起源中心和茶树多样性分布中心[1]，其茶树种质资源共涉及茶组植物35个种3个变种（其中26个种为云南独有），种类和类型约占世界茶树种类的74.5%。目前，共保存有山茶科山茶属茶组植物28个种3个变种共计2 157份茶树种质资源，它们具有明显的地域特色，多以云南特有的大叶茶资源为主，也包括一些中小叶种、小叶种、野生资源和特有地方品种资源。

种质资源的科学鉴定和评价是优异资源发掘和利用的前提。分子标记作为以生物体的遗传物质DNA的多态性为基础的遗传标记在茶树资源遗传多样性分析中被广泛运用[2]，主要包括RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SCAR、ISSR等技术。EST-SSR技术是在SSR标记基础上发展起来的一种新的标记技术，除了具有SSR标记[3-5]的特点外，还有成本低、通用性好、条带清晰、带形容易统计等优点[6]。在茶树遗传多样性、指纹图谱、分子鉴别等研究上得到很好应用，证明是一种非常有效、可靠的分子技术[7]。云南作为大叶茶种质资源最丰富的地区，可为分析茶树的遗传多样性和茶树育种提供物质基础和广阔的利用空间，其中一些特殊的茶树资源是学术研究的重要课题。周萌等[8]对云南地区100份野生和22份茶树品系进行遗传多样性分析，结果表明云南野生茶树品系具有丰富的遗传多样性；刘本英等[9]对云南的134份茶树资源进行遗传多样性和亲缘关系分析，结果各茶组间也表现出丰富的遗传多样性，这都可为云南茶树育种提供一定的理论基础。但是就目前而言，利用DNA分子标记在云南茶树种质资源上的研究报道尚为数不多，对优异资源的筛选还主要单纯依赖茶树生化成分分析，这对茶树育种起到严重的滞后作用。本试验通过选择包括云南不同地区94份大叶茶种质资源为材料，利用28对SSR引物对其进行遗传多样性和亲缘关系分析，以期进一步了解云南大叶茶各地区的种质资源信息，为后期的优良种质资源收集、保护和利用提供科学依据。endprint

1 材料与方法

1.1 材料

在“国家种质勐海茶树分圃”内选择具有代表性的大叶茶资源材料94份，采其新梢一芽二叶4～5枝，放置于预先标号且装有干燥硅胶的自封袋中，-80℃冰箱保存备用。供试材料的基本信息见表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 将各份供试材料分别进行打样磨碎，采用改良的CTAB法[10]提取基因组DNA。利用0.8%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000分光光度计测定DNA的纯度和浓度，稀释至20 ng/μL，-20℃保存备用。

1.2.2 SSR引物及PCR扩增 28对SSR引物用于样品材料的扩增，其序列参照文献[11]～[14]。所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR扩增反应在PTC-200型PCR仪上进行，反应体系为10 μL，包括上下游引物各0.2 μL，10×Buffer（Mg2+）1 μL，dNTP 0.2 μL，Taq酶0.5 U，加ddH2O至10 μL。PCR反应程序为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，退火30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃ 10 min，4℃保存。PCR产物用10%聚丙烯酰胺凝胶在电泳仪上进行电泳检测，电压170 V，时间120 min。银染显色，使用凝胶成像仪拍照记录。

1.2.3 数据处理 电泳图上的条带处理参照张成才等[15]的方法，将电泳图上的条带由大到小按照A、B、C、D、E等依次赋值，缺失条带以“-”表示，统计样品材料的基因型。使用Popgene Ver.1.32软件计算每对引物的观测等位基因数（Na）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、Shannon 信息指数（I）和Fit、Fis、Fst等数值。其中，Fit指计算出的基因型的实际频率与理论期望频率在所在群体中的偏离程度，Fis指基因型的实际频率与理论期望频率在亚群体（居群间或物种间）中的偏离程度，Fst表示亚群体之间的遗传分化程度。根据公式Nm=0.25×（1-Fst）/Fst计算放映基因流强度（Nm）。通过PIC-CALC0.6计算各位点的多态性信息含量（PIC，polymorphism information content），分子系统树状图采用非加权配对平均算术法（UPGMA）聚类分析构建，分析其遗传多样性和亲缘关系。

2 结果与分析

2.1 不同来源大叶茶资源材料的遗传多样性分析

运用28对SSR引物对94份云南地区大叶茶资源的遗传多样性进行分析，测定其等位基因数、Shannon信息指数、观测杂合度、期望杂合度和多态性信息含量数值。图1为28对引物中编号5122扩增产物的聚丙烯酰胺电泳图。28对引物在94份个体中的遗传多样性分析结果见表2。共检测出128个观测等位基因，每个位点扩增出的等位基因数在3～6个之间，平均每个位点为4.57个。Shannon信息指数（I）在0.91～1.66之间，最小为5087位点0.91，最大为1696位点1.66，平均每个位点为1.30，除5087位点Shannon信息指数小于1以外，其它位点值都大于1。观测杂合度（Ho）数值在0.41～0.98之间，最小为1696位点0.41，最大为5115位点0.98，平均值为0.71。期望杂合度（He）数值在0.53～0.78之间，最小为5087位点0.53，最大为1696位点0.78，平均值为0.70。多态性信息含量（PIC）数值在0.476～0.753之间，最小为5087位点0.476，最大为1696位点0.753，平均值为0.643。期望杂合度（He）作为度量群体遗传多样性水平的重要参数，在28个位点中，平均观测杂合度值略大于期望杂合度。12个位点（4119、5061、5129、1696、1926、5017、2049、5123、1051、5073、1651、E-140）的观测杂合度数值低于期望杂合度数值。3个位点（1916、5129、1696）的等位基因数为6个，说明在群体遗传结构中有较高的重要性，而5087位点的等位基因数为3个，具有较低的遗传重要性。多态性信息含量（PIC）是一个衡量位点多态性的重要指标，除位点5087（0.476）的数值在0.25～0.50之间以外，其它27个位点的数值都大于0.50，说明位点5087表现为中度遗传多态性，而其它27个位点表现为高度遗传多态性，表明94份云南地区大叶茶资源材料具有丰富的遗传多态性，都可作为茶树遗传育种的重要材料。

2.2 不同来源大叶茶材料遗传分化分析

对94份材料的不同来源地间遗传分化进行分析，结果（表3）表明，统一来源地内基因多样性（Fis）平均值为-1.0000，并且全部引物都为-1.0000，都表现为杂合体偏高；不同来源地间基因多样性（Fit）平均值为0.6261，表明供试茶树资源总体杂合子不足。不同来源地间遗传分化系数（Fst）为0.8130，表明81.3%的遗传分化系数存在于材料不同来源地间。材料不同来源地间基因流（Nm）平均值为0.0575，基因流较大，说明不同来源地间基因交流程度很高。因此，本试验中供试材料的遗传变异主要存在于不同来源地之间而非同一来源地内。

2.3 不同来源大叶茶材料聚类图与遗传多样性分析

94份供试材料基于Neis遗传距离构建的UPGMA聚类图如图2所示。在大类群中，可将94份材料分为4大类，高良野茶（22）和黄泥河野茶（27）为一个大类。安康大叶茶（1）、大卵圆大叶茶（93）、文家塘大叶茶（94）、温泉原頭茶（68）、下街大叶茶（91）、景新小黄茶（92）、小厂大叶茶（71）、羊岔街野茶（75）、元江磨房茶（78）、腰街大叶茶（76）、育乐野茶（77）、元江软茶（80）、镇沅大叶（82）、者竜峨大叶（81）、孟连大叶茶（85）、三中大叶茶（84）、帮崴坎子茶（86）和大曼吕大叶茶（87）共18份材料聚为一个大类。其它材料则分散分布于聚类图中，形成两个大类。各两份供试材料均具有较大的遗传距离和较低的遗传相似度，下街大叶茶（91）和景新小黄茶（92）遗传距离最小为0.3391，相似度0.7124；其次是蚌岗大叶茶（8）和德思里茶（17）的遗传距离为0.3700，相似度0.6908；帮崴坝子茶（86）和大曼吕大叶茶（87）的遗传距离为0.3808，相似度0.6833。从整个遗传聚类图来看，结果与多态性信息含量等参数值分析结果一致，表现出丰富的遗传多样性。endprint

3 讨论与结论

云南茶树种质资源极为丰富，一些珍稀资源具有重要的研究价值和利用潜力。多态性信息含量（PIC）值作为衡量资源遗传多样性的重要指标，PIC<0.25时位点表现为低度多态性，0.250.5时为高度多态性。本研究通过利用28对SSR引物对云南不同地区94份大叶茶资源进行遗传多样性分析，多态性信息含量（PIC）值在0.476～0.753之间，平均值为0.643。PIC>0.5的有27对，占96.4%，27对引物表现高度多态性，说明94份供试茶树资源具有丰富的遗传多样性。这与刘本英等[11]分析云南地区其它材料的结果一致。本研究通过选择之前尚未进行过遗传多样性分析的种质材料进行分析，并且分析结果明显高于其它地区的相关研究结果。另外，从观测等位基因数、Shannon 指数和多态性信息含量分析，所选的28对引物中较好的引物有2049、5115。但所选的引物都不是最有效的引物，还不能充分表现茶树资源供试材料的多态性。等位基因数变幅不大，而Shannon信息指数变幅在0.91～1.66之间，等位基因数与Shannon信息指数在一定程度上变化趋势大体一致，但是Shannon信息指数能更好地反映群体的遗传多样性程度，可作为更好的评判参照标准。

通过聚类分析发现，94份供试材料可分为4个大类，多个亚群。各两份供试茶树资源间具有较大的遗传距离和较低的遗传相似度，遗传距离最小的下街大叶茶（91）和景新小黄茶为（92）0.3391，相似度0.7124。整个聚类除个别按照地域特点或者种质学聚集外，大部分材料都显示无规律聚集。图中按照地域特点聚集较明显的分别有勐海县布朗山的28号（吉良大叶）和29号（吉良绿梗绿芽茶）、新平的73号（新平茶）和74号（新平峨毛茶）、凤庆的45号（马街野生茶）和32号（津秀大叶）、景谷的72号（小景谷大叶）和33号（景谷红芽直立茶）分别单独聚在一个小类，且与其它材料距离较远，说明它们有可能有相同的遗传基因，可作为育种工作的重要研究材料。按照种质学聚集较明显的来自麻栗坡的两份汝城毛叶茶茶树资源（麻栗坡白毛茶、坝子白毛茶）却分散在不同的类群，遗传距离较远。整个遗传图谱表现出丰富的遗传多样性，可能与不同地区不同种质学等因素有极大关系，并且分析结果与季鹏章等[16-21]的研究结果一致。

云南作为茶树的原产地，种质资源丰富，遗传背景复杂，但对其的SSR标记工作进行缓慢，未能建立起相关的茶树基因组SSR标记体系。这对构建茶树资源核心种质库、分子指纹图谱等研究有一定的影响。对此，今后应结合云南优质、高抗、功能性茶树品种筛选这个育种目标，加快云南茶树资源的DNA分子技术研究，使其成为当前的一个重要课题，这对云南乃至全国大叶茶优异种质资源的发掘、创新及运用和加快育种目标实现的步伐有重要作用。

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