产香酵母发酵处理烟草花蕾条件优化及烟用香料制备研究

许春平+孟丹丹+冉盼盼

摘要：通过正交试验，利用产香酵母对烟草花蕾进行发酵优化，然后对发酵产物进行美拉德反应，利用同时蒸馏萃取方法提取香味成分后用GC-MS分析香味成分。结果表明，香味物质主要有63种，其中软脂酸、肉豆蔻酸、棕榈油酸、苯甲醇、苯乙醇、6，10，14-三甲基-2-十五烷酮等香气浓度大；巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯、油酸酰胺、2-正戊基呋喃香气阈值低，是烟草中关键的致香物质，对烟草香气贡献突出。以香气总量为指标，35 ℃、pH=5、12 h、6%（V/V）接种量时香气总量最高，高达760.74 μg/g。以水溶性氨基酸和水溶性还原糖的含量为指标，发酵处理在35 ℃、pH=5、24 h、5%（V/V）接种量时氨基酸含量和还原糖含量最高，分别为2.860 52、0.151 24 mg/g。香气含量与氨基酸和还原糖含量的关系不是正相关关系。

关键词：产香酵母发酵；美拉德反应；烟草花蕾；工艺

中图分类号：S571.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）01-0100-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.01.026

Abstract： Aroma-producing yeast was used to carry out to optimize the fermentation with tobacco bud by orthogonal design. Maillard reaction was carried out. Then，the aroma components was extracted by simultaneous distillation extraction method， and the aroma components were analyzed by GC-MS. The results showed the aroma components were mainly included 63 kinds，and myristic acid，myristic acid，dihydroactinidiolide，phytone，damascenone，megastigmatrienone，caryophyllene oxide，cembrene，oleic acid amide and 2-pentylfuran with lower odor threshold were the key aroma compounds in tobacco with outstanding contribution to tobacco aroma. Taking the total aroma amount as the index，under the optimal fermentation condition of 35 ℃，pH=5，12 h with 6% inoculating amount， the total aroma amount reached the highest level of 760.74 μg/g. Taking the contents of water-soluble amino acid and water-soluble reducing sugar as the index，under the fermentation condition of 35 ℃，pH=5，24 h with 5% inoculating amount，the contents of amino acid and reducing sugar reached the highest level. The highest amino acid content reached 2.860 52 mg/g，while the highest sugar content could reach 0.151 24 mg/g. The relationship between aroma content and amino acid and reducing sugar contents was not positively correlated.

Key words： aroma producing yeast； maillard reaction； tobacco bud； processing

煙叶发酵是卷烟加工中重要的环节，良好的发酵工艺可以改善烟叶品质，未经发酵处理的烟叶不同程度地有多种品质缺陷，生青杂气和刺激性突出，没有陈化烟叶的特征香气，香气质单调，香气量不足，不能直接用来生产卷烟。通过发酵后，烟叶青杂气和刺激性下降，烟草特征香气显露，可用性显著提高，因此烟叶最好经过发酵处理用于卷烟[1-3]。根据发酵条件和方法的不同，烟草发酵被分为自然发酵和人工发酵，自然发酵是在库房室温条件下将烟叶贮存一段时间，在自然条件下陈化烟叶，使烟叶更符合吸食要求[4-6]。这种发酵方法被欧美和中国云南普遍采用。人工发酵是在特定的人工强化温度和空气湿度的发酵室内，加速陈化烟叶，使其更适合吸食要求的发酵方式。这种方法是20世纪50年代前苏联科学家发明并在东欧和中国被推广应用的一种发酵方法[7]。

近年来，国内外利用微生物增加烟叶香气的研究，已有报道。朱大恒等[8]报道了以1株产香菌的发酵产物作为香料可使卷烟品质明显改善，烟气醇和而饱满，能减轻卷烟杂气和刺激性，并用烟末、豆粕、烟秸杆等作为产香菌的发酵物，生产香精应用于烟叶发酵，效果比较明显。郑小嘎等[9，10]分析了人工发酵烟叶增香途径的研究进展，并利用真菌菌剂处理上部叶烤烟烟丝，处理后烟叶香气质提高，香气量增加，刺激性减小，余味舒适，烟叶品质明显提高。周瑾等[11]发现菌株u-81能有效地将烟叶中的蛋白质分解为氨基酸，再加外源葡萄糖在一定温度下发生反应提升烟叶品质。左天觉等[12]证实烟叶中的烟碱含量不仅与烟草的品种、产地、气候、施肥等有关，也与后期工艺水平以及微生物的处理有关。本试验利用产香酵母处理烟草花蕾制备烟用香料，并利用GC-MS对其进行挥发性成分分析，为进一步研究烟用香料提供参考。endprint

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试材料云烟87烟草花蕾；酿酒高活性酵母；葡萄糖、谷氨酸、磷酸氢二钠、磷二氢钠、3，5-二硝基水杨酸钠、丙二醇、1 mol/L NaOH、1 mol/L H2SO4、二氯甲烷、0.821 1 mg/mL乙酸苯乙酯等。

仪器：Q-100A3型旗箭粉碎机（上海冰都电器有限公司），HS-4型恒温水浴锅（上海医疗器械五厂），PL203型电子分析天平（0.000 1 g），RIGOL UItra-3400型紫外分光光度计（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），DGX-9143型电热恒温鼓风干燥箱（上海福玛设备有限公司），BIORIDGE卢湘仪TGL-16M离心机，蒸馏萃取装置（郑州科技玻璃仪器厂），6890/5973型气相色谱/质谱联用仪（安捷伦科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 产香酵母活化方法 将产香酵母用35～40 ℃的水活化15～20 min，然后温度降至34 ℃以下活化1～2 h。将10 g产香酵母放入250 mL的锥形瓶中，加入100 mL 35～40 ℃的无菌水在32 ℃的水浴锅中活化2 h，备用。

1.2.2 烟草花蕾灭菌处理方法 将干燥的云烟87烟草花蕾粉碎，过60目筛，置于500 mL锥形瓶中以料液比1∶10的比例加入200 mL去离子水。放入水浴锅中沸水浴30 min达到灭菌效果。

1.2.3 发酵条件正交优化试验 采用正交试验设计，选用L9（34）正交试验对产香酵母发酵条件（温度、发酵时间、发酵pH、加菌量）进行了优化试验设计。试验水平与因素见表1。

1.2.4 DNS法测定还原糖 采用DNS法测定水溶性还原糖：配制3，5-二硝基水杨酸钠试剂（DNS），将6.5 g的3，5-二硝基水杨酸钠和2 mol/L NaOH加到500 mL含有182 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5 g苯酚和5 g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加去离子水定容至1 000 mL，贮存于棕色瓶中室温放置7～10 d后標定使用。取1.0 mg/mL葡萄糖标准溶液，按表2加入试剂沸水浴中加热5 min，冷水冷却后定容至25 mL摇匀，在520 nm波长测定吸光度。测得还原糖数据绘制标准曲线，方程为y=0.418 2x+0.008 7，R2=0.997 3。通过标准曲线及稀释倍数计算还原糖含量，计算公式：还原糖含量（mg/g）=（还原糖浓度×稀释倍数）/样品质量。

1.2.5 茚三酮法测定氨基酸 采用茚三酮法测定水溶性氨基酸：茚三酮显色液，2 g茚三酮加入100 mL去离子水溶解，放入棕色瓶中保存，每次使用前配置；pH 8缓冲液，0.2 mol/L Na2HPO4 94.7 mL与0.2 mol/L NaH2PO4 5.3 mL合并，混匀。取0.2 mg/mL谷氨酸标准溶液按表3加入试剂沸水浴中加热15 min，冷水冷却后定容至10 mL摇匀，在570 nm波长下测定吸光度。测得氨基酸数据绘制标准曲线，得到方程为y=0.550 9x-0.210 6，R2=0.992 9。通过标准曲线及稀释倍数计算氨基酸含量，计算公式：氨基酸含量（mg/g）=（氨基酸浓度×稀释倍数）/样品质量。

1.2.6 美拉德反应处理方法 在酶解试验后的样品中各加入20 mL丙二醇，调pH为7（1 mol/L NaOH调至pH=7）用封口膜封口放入烘箱，70 ℃反应12 h[13-15]。

1.2.7 同时蒸馏萃取提取香味物质 将美拉德反应产物倒入同时蒸馏萃取装置一端的平底烧瓶中，加入100 mL去离子水，用电子调温电热套加热，装置的另一端蒸馏瓶中注入50 mL二氯甲烷，于60 ℃水浴中加热。同时蒸馏萃取当水与二氯甲烷分层开始计时2.5 h后萃取结束，在二氯甲烷萃取液中加入含量为0.821 1 mg/mL的乙酸苯乙酯1 mL和无水硫酸钠若干，静置过夜。然后于35～40 ℃条件下浓缩。浓缩至约1 mL转至样品瓶中，低温密封保存，用于GC-MS进行定量分析[16]。

1.2.8 GC-MS条件 色谱条件，色谱柱为HP-5MS 色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm），进样口温度280 ℃，分流比10∶1，进样量1 μL，载气为氦气，载气流量为3 mL/min，升温程序为初始温度50 ℃，以4 ℃/min升至280 ℃。质谱条件，EI源，接口温度270 ℃，电子能量70 eV，四极杆温度150 ℃。采集模式，扫描[17]，质量扫描范围35～550 m/z。挥发性物质含量（μg/g）=（内标物质量×挥发性物质峰面积×1 000）/（烟草花蕾质量×内标物峰面积）。

2 结果与分析

2.1 香味成分物质分析

利用Nist11谱库将质谱图中各色谱峰进行检索，同时进行人工解析，对化学成分进行定性分析。采用内标法（内标物0.821 1 mg/mL的乙酸苯乙酯）[假定相对校正因子（相对于内标）为1]对物质进行定量，结果见表4。

从表4可以看出，烟草花蕾经产香酵母发酵美拉德反应加香后，经GC-MS分析后共有香味物质63种，主要包括醇18类、醛9类、酸10类、酯4类、酮10类、稀13类、呋喃、吡啶、吲哚、胺类等，其中软脂酸、肉豆蔻酸、棕榈油酸、苯甲醇、苯乙醇、6，10，14-三甲基-2-十五烷酮等香气浓度大；巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯、油酸酰胺、2-正戊基呋喃香气阈值低，是烟草中关键的致香物质，对烟草香气贡献突出。

2.2 发酵条件正交试验结果

以氨基酸和还原糖含量为指标优化发酵条件，发酵条件正交试验每个样品做3个水平的平行试验，结果如表5所示。

从表5中可以看出，样品6的氨基酸含量最高可达到2.860 52 mg/g，样品8的还原糖含量最高可达到0.151 24 mg/g。样品1的氨基酸含量最低，样品5的还原糖含量最低。发酵处理的较优水平为A2B2C2D2，A2′=A3′，B2′=B3′，C1′，D1′，主次因素为A>B>D>C、A′=B′=D′>C′。endprint

香气总量是样品4中含量最高，达到760.74 μg/g，样品8的香气总量最低，含量为385.30 μg/g，烟草花蕾香气总量由高到低依次分别是样品4、样品7、样品2、样品3、样品1、样品5、样品9、样品6、样品8。样品6的氨基酸含量最高，样品8的还原糖含量最高，但是样品6、样品8香气总量都不是最高，样品1的氨基酸含量最低，样品5的还原糖含量最低，但是样品1、样品5香气总量并不是最低。说明香气含量与氨基酸和还原糖含量的关系不是正相关关系。

3 小结

以烟草花蕾为原料，经产香酵母的发酵处理，通过正交试验优化发酵处理条件，然后产香酵母发酵正交优化处理后进行美拉德反应，然后利用同时蒸馏萃取方法提取香味成分，GC-MS分析香味成分，得出发酵处理后经美拉德反应同时蒸馏萃取提取的香味物质主要有63种，主要包括醇18类、醛9类、酸10类、酯4类、酮10类、稀13类、呋喃、吡啶、吲哚、胺类等，其中软脂酸、肉豆蔻酸、棕榈油酸、苯乙醇、三环稀等香气浓度大；巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯、油酸酰胺、2-正戊基呋喃香气阈值低，是烟草中关键的致香物质，对烟草香气贡献突出。产香酵母发酵正交试验及香气总量结果可以看出，氨基酸含量最高可达到2.860 52 mg/g，还原糖含量最高可达到0.151 24 mg/g。但是氨基酸还原糖最高时，所对应的香气总量并非最高，说明香气含量与氨基酸和还原糖含量的关系不是正相关关系。

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