罗田板栗褐变产物的分离及稳定性研究

李琳玲+郑永良+张雪华

摘要：研究以罗田板栗（Castanea mollissima）为研究材料，通过传统的回流提取法提取栗仁中的主要褐变物质并进行稳定性研究。结果表明，其最佳提取工艺条件为乙醇体积分数70%、提取时间5 h、提取温度45 ℃；蒽醌类物质在20～80 ℃温度下含量较为稳定；80 W紫外线对蒽醌类物质影响较大；5%谷氨酸钠使蒽醌类含量快速下降。

关键词：板栗（Castanea mollissima）；酶促；褐变物质；蒽醌类化合物；稳定性

中图分类号：S664.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）01-0093-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.01.024

Abstract： In this study，the research material is Luotian chestnut. The browning material in chestnut are extracted by conventional reflux extraction and conducted stability study. The results showed that the optimum extraction conditions were determined in 70% ethanol， the extraction time in 5 hours， extraction temperature on 45 ℃. The content of anthraguinone was stable at 20～80 ℃. Also found that 80 W UV had great influence on anthraquinones and 5% glutamate into anthraguinone content declineal rapidly， food additives in the conclusion.

Key words： chestnut（Castanea mollissima）； enzymatic； browning substances； anthraquinone； stability

板栗（Castanea mollissima）属壳斗科栗属植物，为中国传统干果之一。目前，板栗分布于北半球的亚洲、欧洲、非洲和美洲大陆[1，2]。湖北省罗田县是中国南方重要的板栗主产区，栽培面积4.8万hm2，年产板栗约3.0万t左右，板栗产业年产值达4.8亿元，在当地经济发展中起着不可替代的作用[3]。

板栗属顽拗性种子，采后极易发生褐变和衰老，造成严重的经济损失[4]。板栗在加工过程中，去皮、机械损伤、切分磨碎或长时间暴露放置均易使果肉发生褐变。褐变除了造成外观色泽改变，也会造成风味与口感变化及营养物质的损失，大大降低了商品价值[5]。一般认为，果蔬发生褐变是由于采收和采后处理过程中造成了不同程度的损失，细胞内原本隔离的酚类物质和酶相互接触，同时大量氧气通过伤口进入，酚类物质氧化成蒽醌类，从而聚合成黑色素类物质[6]。中国作为板栗生产大国，许多科研工作者针对控制板栗加工贮藏中的褐变进行了研究[7-9]。近年来，为了提高板栗的商品价值，中国科研工作者开展了板栗深加工产品的研发，如板栗罐头、板栗果脯、板栗蓉、板栗酱等，这些产品开发都受到褐变问题的制约，因此解决褐变问题是板栗深加工的关键。研究以中国板栗第一县——罗田红光油栗作为研究材料，探讨板栗深加工过程中，温度、提取时间、光照、主要食品添加剂对板栗蒽醌类物质稳定性产生的影响，以期为板栗深加工工艺提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

板栗采自湖北罗田，果实大小、着色、成熟基本一致，无病虫害和损伤，品种为红光油栗。

1.2 主要试剂及设备

试剂：无水乙醇、无水甲醇、氯仿、硫酸、醋酸镁、去离子水。

仪器：RE52-99型旋转蒸发仪，SHZ-O（III）型循环水式真空泵，TU-1810型紫外可见分光光度计，8F-06A型索式提取器，恒温箱，电子天平等。

1.3 方法

1.3.1 板栗栗仁褐變的方法 板栗栗仁发生酶促褐变的多酚氧化酶的最适反应温度一般为40～60 ℃[10]，但同时要考虑到温度过高可能会引起其他非酶促褐变，影响试验结果。因此，先将生板栗剥壳，然后将板栗仁打碎放置在45 ℃的恒温箱里5～7 d，使其充分发生褐变，并作为待提取样品。

1.3.2 板栗仁褐变产物的提取分离方法 提取蒽醌类化合物时选用的方法是索式提取法，先称取适量板栗粉样品，用两层纱布将其包裹好，塞入到提取管中，且不能超过虹吸管的最高处，然后在提取瓶中加入乙醇溶液，一般不超过提取瓶2/3，设置适当温度开始回流提取[11]，得到粗提取液。然后通过旋转蒸发仪将得到的粗提取液在70 ℃下减压回收乙醇溶液，该过程最需要注意的是先减压，再开动电机转动蒸馏烧瓶，结束时，应先停电动机，再通大气，以防蒸馏烧瓶在转动中脱落。待乙醇蒸发出去后，将得到的提取液加入20%硫酸，其目的是由于蒽醌化合物一般都是与糖等物质形成结合物，通过硫酸使其水解为游离苷元，以便萃取。利用氯仿萃取，再通过旋转蒸发仪回收氯仿（36 ℃）得到蒽醌提取液。

1.3.3 蒽醌含量的测定

1）显色剂的配制。称取0.4 g MgAc，加入甲醇溶液配制成100 mL，即可得到0.5%的醋酸镁-甲醇溶液，充分摇匀待用。

2）标准曲线的制备。标准称取1，8-二羟基蒽醌100 mg，用甲醇溶解并定容为100 mL标准液，分别吸取10、25、50、100、150、200、250 μL标准溶液，加0.5%醋酸镁-甲醇溶液定溶至10 mL，充分摇匀后于510 nm处测定吸光度[12]。并以0.5%醋酸镁-甲醇溶液作空白对照，测定结果见表1。结果表明，1，8二羟基蒽醌标准溶液在1.000～25.000 mg/L吸光度呈现良好的线性关系（r=0.998 8），其浓度-吸光度关系的回归方程为A=0.046 6C+0.000 6。其中A为吸光度，C为板栗褐变产物（蒽醌类物质）的浓度（mg/L）endprint

1.3.4 板栗褐变产物（蒽醌化合物）的含量测定 按上述工艺将提取液离心后，按一定的比例稀释，在510 nm测定吸光度，并根据标准回归方程计算出蒽醌化合物的提取率。

蒽醌化合物提取率=CV/1 000 W×100%

式中，V为提取液的体积（L），W为板栗粉的用量（g）。

2 结果与分析

2.1 提取试验的优化设计

2.1.1 提取温度对蒽醌类物质提取率的影响 以提取温度作为研究因素，蒽醌提取率（mg/L）作为参考指标，以80%乙醇作为溶液，分别在35、40、45、50、60 ℃下进行试验，每组提取5 h。根据结果绘制曲线（图1）可明显看出，随着温度提高蒽醌类物质的提取率在明显增加，且在40～50 ℃存在明显的增长速度最高点，温度过高会引起其他的一些非酶促反应，会影响蒽醌的提取率，因而选取45 ℃更为适合。

2.1.2 提取时间对蒽醌类物质提取率的影响 以提取时间作为研究因素，蒽醌提取率作为参考指标，以80%乙醇作为溶液，分别在2、3、5、6、7 h下进行试验，每组在45 ℃下提取。由图2可以看出，随着提取时间的增加，提取率也越来越高，同时逐渐趋近于最大值，因此提取时间选取5 h为宜。

2.1.3 乙醇体积分数对蒽醌类物质提取率的影响 以乙醇体积分数作为研究因素，蒽醌提取率作为参考指标，在45 ℃下提取5 h，乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%进行试验。由图3可知，乙醇体积分数对提取率有很明显的影响，随着体积分数的增大提取率先逐渐增大，然后再逐渐减小。故选用70%乙醇。

2.2 蒽醌类物质的稳定性研究

由于板栗的药用价值极高，目前市场上以板栗为原料的食品也层出不穷，板栗的褐变却严重影响板栗的食用价值。对蒽醌类物质的稳定性进行分析研究有助于对板栗褐变的控制。

2.2.1 温度对蒽醌类物质的稳定性研究 分别取浓度为5、10、15 mg/L蒽醌类物质各5组分别放置于20、40、60、70、80 ℃恒温箱中7 d，并用紫外分光光度计测量蒽醌类物质吸光度。由表2可以看出，随着温度的不断变化吸光度的改变不明显，即温度对蒽醌化合物的稳定性的影响不大。因此，在板栗的生产过程中，对于防褐变的措施上，不必过多的考虑温度对褐变的影响。

2.2.2 光照对蒽醌类物质稳定性的影响 分别取浓度为5、10、15 mg/L蒽醌类物质各4组，分别置于黑暗、40 W白炽灯、100 W白炽灯、80 W紫外线下照射处理7 d，测定其吸光度，试验结果见表3。由表3可知，光照对蒽醌类物质的稳定性有较强的影响，且随着光照的增强其吸光度越来越小，也就是浓度越来越低。特别在紫外光下，其浓度降低非常明显，稳定性最差，在储存过程中一定要注意光照条件。

2.2.3 食品添加剂对蒽醌类物质稳定性的研究 分别取浓度为5、10、15 mg/L蒽醌类物质各4组，分别添加5%的柠檬酸、氯化钠、谷氨酸钠、维生素C放置7 d，分别测定其吸光度，试验结果见表4。以上4种添加剂对于蒽醌类物质的稳定性都有影响，吸光度均有所下降，因此在板栗食品的加工生产中，加入适当添加剂，在一定程度上可为食品护色，同时也可以防止板栗褐变。

3 讨论

3.1 分离试验

目前，针对果蔬中蒽醌类化合物提取及褐变开展了很多研究。何英等[13]开展关于石榴果皮酶促褐变产物的提取、分离与结构鉴定，通过试验确定了最佳提取工艺为75%乙醇作为提取剂，提取时间25 min，提取温度为25 ℃。并做了超声波提取与传统提取的对比。香蕉酶促褐变研究结果显示，75 ℃水浴处理5 min，或100 ℃处理20 s可以钝化PPO活性，从而降低褐变[14]。杨心宇等[15]对板栗仁酶促褐變产物进行了提取并对其稳定性进行了研究，确定水浴回流法提取酶促褐变产物最佳工艺条件为乙醇体积分数75%，提取时间为6 h，料液比为1∶2，提取温度为45 ℃。本研究对于板栗褐变产物的提取分离得到的最佳提取工艺为提取液乙醇体积分数70%，提取时间5 h，提取温度45 ℃，与以上各个最佳提取工艺相比有所区别，最明显的是乙醇体积分数和提取时间，很可能是因为不同地区板栗蒽醌类物质含量不同所导致的差异。

3.2 稳定性试验

大部分果蔬中都存在蒽醌类物质，它是导致果蔬褐变的主要因素。目前单独针对蒽醌类物质稳定性研究不多见。魏玉辉等[16]研究发现随着时间的变化，蒽醌类物质的含量几乎不变，较为稳定。杨芙莲等[17]研究发现pH对蒽醌类物质的影响极大，从而得出了通过调节pH来阻止褐变的发生。陈德经[18]研究认为，板栗仁黄色素在黑暗和日光照下变化不大，但在白炽灯光及紫外照射下，色素的稳定性较差。本研究主要从温度、光照、食品添加剂3个方面进行了试验，发现光照、食品添加剂对蒽醌的稳定性有较大的影响，温度影响较小。在光照对蒽醌物质的影响中，紫外线对蒽醌的影响较为显著。同时也可添加一定的食品添加剂，使其发挥更好的保存效果。但是添加剂是否会和板栗中一些成分结合形成对人体有害的物质，有待更深入的研究。

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