一年生喜树生长规律及叶片中喜树碱含量季节性变化研究*

刘 波刘曦子 苏禄晖朱丽红杨 意

（1.上海市医药学校，上海 200135；2.南京大学金陵学院化学与生命科学学院，江苏 南京 210037；3.上海市浦东新区公路管理署，上海 200129）

喜树 （Camptotheca acuminata） 为珙桐科（Nyssaceae）喜树属（Camptotheca Decne.）植物，我国特有高大落叶乔木，主要分布于我国长江流域、西南各省区及印度部分地区，属国家二级保护树种[1-2]。喜树根、茎、叶、果实及种子中提取的喜树碱（Camptothecin，CPT）是迄今为止发现的唯一一种拓扑异构酶I（Topoisomerase I）的抑制剂，具有广谱抗癌活性，可用于胃癌、直肠癌、慢性粒细胞性白血病和急性淋巴性白血病的治疗[3-6]。

近几年来，各国学者对喜树碱的生物活性成分进行了广泛的研究[7-16]，喜树已成为世界性热门研究课题。已有文献报道了不同种源喜树中CPT含量、不同省区喜树叶中CPT含量、喜树各器官中CPT含量、喜树不同发育阶段叶片中CPT含量以及不同生长季节嫩叶和成熟叶中喜树碱的动态变化[13，17-22]，且喜树各组织器官中，嫩叶中CPT含量可以达到植株地上部分平均含量的4倍[23-24]，但对于1年生喜树生长发育以及不同叶龄喜树叶片中CPT含量研究较少。本文采用HPLC色谱法对喜树嫩叶和成熟叶中CPT的含量以及不同叶龄叶片中CPT含量进行研究，同时对当年生喜树生长规律进行研究探讨，以期为药用喜树种植栽培，科学合理地开发喜树资源，以及喜树和喜树碱产业化生产，提高资源利用率和生产率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为1年生喜树，种源为四川都江堰，种植地为上海市浦东新区划某绿化养护公司苗圃。以整个植株、植株新梢上的嫩叶（枝顶1～3位叶）和成熟叶作（枝条中下部叶，叶片深绿色）为试验材料。

2016年4～11月份，分别于每月中旬及月底采集喜树嫩叶与成熟叶，采集时间均为早上9∶00。不同叶龄叶片喜树碱含量测定，每5天采集1次喜树叶片，采集时间均为早上9∶00。

所有采集后的样品均用清水洗净，60℃烘干，恒重，粉碎至60目，干燥器中保存备用。

1.2 仪器与试剂

Jasco高效液相色谱仪、975型紫外检测器、TG328A型电子天平、Heraeus Biofuge 22R型高速冷冻离心机、Buchi R210型旋转蒸发仪、索氏提取器。

乙腈（色谱纯）、无水乙醇（分析纯）、95%乙醇和重蒸馏水。

1.3 色谱条件

色谱Waters ODS柱（25 cm×4.6 mm）；流动相：乙腈 - 水（V/V=4∶6）；流速：1 mL/min；检测波长：254 nm；进样量：10 μL；柱温：25 ℃。

1.4 标准曲线的配制

精密称取喜树碱对照品3.5 mg，置于100 mL容量瓶中，以乙腈-水（4∶6）为溶剂，超声溶解并稀释至刻度，摇匀、定容，备用。

1.5 标准曲线的绘制

分别精密吸取喜树碱1.0、2.0、3.0……9.0 mL于10 mL容量瓶中，用相同溶剂定容至刻度，摇匀。按照上述色谱条件，分别取稀释后样品及原标准溶液进行分析，每个样品重复测定3次，取峰面积的平均值。得峰面积（Y）与喜树碱浓度（X）的线性回归方程：Y=1 807.49X-1 343，R2=0.999 5。

1.6 喜树碱提取

精密称取干燥喜树叶粉3.000 g，用30 mL 95%乙醇，索氏提取8 h，提取3次，合并提取液。用移液管精密吸取提取液200 μL，移入2 mL离心管中，用95%乙醇稀释6倍，12 000 r/min条件下离心5 min，精密吸取上清液，直接进样，计算喜树碱提取率。

1.7 喜树生长测定

2016年4～11月，于每月中旬、月底选择10株喜树幼树，分别用卷尺和游标卡尺测定株高、基径。测定时间均为早上9：00。

喜树生物量测定：用TG328A型电子天平精确称定树根、茎、叶，105℃左右烘干6 h，取出，精密称重至恒重。

2 结果与分析

2.1 喜树高生长动态变化

由图1可以看出，1年生喜树高生长呈现慢-快-慢的“S”型变化趋势，即4～5月份高生长速率较慢，6月份高生长速率迅速增大，6月中旬～7月中旬高生长最快，生长速率最大值出现在7月中旬，此时苗高为46.39 cm，生长速率为0.816 0 cm/d，后喜树生长速率逐渐降低，10月中旬后喜树高生长迅速减慢，11月末喜树高生长趋向停止。

图1 1年生喜树树高动态变化

2.2 喜树粗生长（基径）动态变化

由图2可以看出，1年生喜树粗生长亦呈现慢-快-慢的“S”型变化趋势，即4～5月份高生长速率较慢，6月份高生长速率迅速增大，6月中旬～7月中旬高生长最快，生长速率最大值出现在7月中旬，此时，苗基径为5.55 mm，生长速率为0.121 7 mm/d，后喜树粗生长速率逐渐降低，10月中旬后喜树粗生长迅速减弱，11月末喜树基径粗生长趋向停止。

图2 1年生喜树基径动态变化

2.3 喜树总生物量动态变化

由图3可以看出，1年生喜树总生物量也呈现慢-快-慢的“S”型变化趋势，即4～5月份总生物量增长速率较慢，6月份增长速率迅速增大，6月中旬～7月中旬生物量增长最快。

图3 1年生喜树生物量动态变化

总生物最大值出现在7月中旬，此时总生物量为2.796 5 g/株，增长速率为0.070 3 g/d·株，后喜树总生物量增长速率逐渐降低，10月中旬后喜树总生物量增长迅速下降，11月末喜树基径粗生长趋向停止。

2.4 喜树叶片中喜树碱含量的季节性变化

由图4可以看出，在喜树1年生长过程中，嫩叶和成熟叶中喜树碱含量均为单峰曲线。从4～7月份，嫩叶与成熟叶中喜树碱含量均呈上升趋势，其中嫩叶在7月中旬含量达到最大值，为0.912 9‰，成熟叶中喜树碱含量亦在7月中旬达到最大值，为0.591 68‰。后嫩叶与成熟叶中喜树碱含量均呈降低趋势，嫩叶与成熟叶中喜树碱含量均在11月份最低，分别为0.141 8‰和0.079 1‰。比较显示，嫩叶与成熟叶中喜树碱含量均在6月下旬、7月中旬含量最高，与其他月份相比差异显著（P＜0.05）。主要原因是这个时期，光照、温度、水分及其他生理生态因子均适宜喜树生长，植物体内各生理代谢活动旺盛，合成的次生代谢产物喜树碱的速率较快。此后CPT含量持续降低，至11月下旬，嫩叶与成熟叶中CPT含量明显降低，并且较当年4月中旬的含量低，而此时，喜树体内各生理代谢活动亦相对稳定并逐渐减弱。在整个生长期内，嫩叶中CPT含量均高于同期成熟叶中的CPT含量，差异极显著（P＜0.01）。喜树叶片中喜树碱含量与喜树1年中的生长和生理活动过程相关。

图4 不同月份喜树叶片中喜树碱含量变化

2.5 喜树不同叶龄叶片中喜树碱含量变化

由图5可以看出，叶片中CPT含量与叶龄（展开天数）呈负相关，叶龄愈小，喜树碱含量愈高，叶龄愈大，CPT含量愈低。叶龄5天时，CPT含量出现最大值，为2.098 2‰，叶龄为10天的喜树叶，CPT含量为1.983 9‰，后随着叶片叶龄逐渐增大，CPT含量却出现急剧降低的变化趋势，当叶龄为70天时，CPT含量最低，为0.092 3‰。

图5 CPT含量-叶龄动态变化

3 结论与讨论

刘丽杰等[13]对处于不同发育阶段的当年生喜树叶中CPT含量变化的研究发现，其成熟叶CPT含量在6月份达到最高值，此后逐渐减少，在8～9月份之间CPT含量略有增加。Liu等[26]研究结果显示，喜树叶片中CPT含量从4月至10月平均每月下降11%；张玉红等[27]经研究发现，喜树嫩叶中CPT含量为一单峰曲线，在7月份达到最高值。郭勇[28]等研究显示，喜树是嫩叶还是成熟叶，在生长期内，其CPT含量变化均为双峰曲线，分别在6月和9月达到峰值，其中以6月份CPT含量最高。张显强等[15]经研究发现，喜树叶片中的CPT含量4～5月份逐渐上升，6～11月，CPT含量均不高，且不断下降。本研究喜树生长期内，无论是嫩叶还是成熟叶，CPT含量变化均为单峰曲线，且CPT含量变化与喜树生理变化过程一致，这一研究结果与张玉红[27]的研究结论相同，对于不同叶龄喜树叶中喜树碱含量，叶龄为5天的喜树叶中含量最高，后逐渐降低，这与郭勇[28]的研究结论相同。研究表明，轻度遮荫，喜树叶片喜树碱含量较全光照的有所提高[29-30]，适当低磷胁迫可以增加幼苗及叶片中喜树碱含量[31]，不同土质可影响喜树幼苗生长及叶片中的喜树碱含量，花土栽培较适合喜树幼苗的生长和叶片中喜树碱产量的提高[31]。

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