贵阳地区2015年手足口病柯萨奇病毒A6、A10型的检测分析*

杨兴林,洪章萍，王 艺，李 丽，梁跃东△,黄 海

(1.贵州省贵阳市公共卫生救治中心 550004；2.贵州医科大学检验学院，贵阳 550004)

手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)是由肠道病毒(EV)引起的出疹发热急性传染病，引起HFMD的病毒属于小RNA病毒科EV属，引发HFMD 的病毒有20多个血清型，包括柯萨奇病毒A组(coxsackie virus A,CVA)的2、4、5、7、9、10、16型等，B组(coxsackie virus B,CVB)的1、2、3、4、5型等，肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)，埃可病毒(echovirus,ECHO)等。其中以EV71及CVA16型较为常见。目前有研究报道，发现其他型EV也能导致HFMD。近年来在欧洲及我国周边部分国家爆发的HFMD疫情中，CVA6、CVA10型等已经替代EV71和CVA16被作为主要致病病原体。2008年在新加坡HFMD的流行,病毒血清型以CVA6、CVA10型为主[1]，同年芬兰爆发了CVA6、CVA10型为主的HFMD[2]，2010年法国HFMD病原调查中，CVA10和CVA6型是主要型别[3]。近几年在我国广东、福建等地也相继有CVA6型和A10型引起HFMD的报道[4-6]。

2013年4-6月本课题组前期开展了1 410份HFMD临床标本病原研究报道[7]，对100份其他血清型EV抽取标本进行PCR产物测序分析，结果CVA6为46例、CVA10为30例、CVA5为10例、CVA2为6例、CVA3和CVA4各2例、CVAB2和ECHO 16各2例。CVA6和CVA10型为本地区HFMD的优势EV型别。为进一步了解贵阳地区引起HFMD的CVA6和CVA10型EV的病原构成，拟通过建立一种荧光定量RT- PCR方法，快速筛查HFMD 病原提供实验依据，为临床EV的诊断提供一种有效、快速的检测手段。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年5月20日至6月19日，在贵阳市公共卫生救治中心感染科门诊的HFMD患儿607例，年龄1个月至11岁，男359例，女248例。诊断标准参照均符合《HFMD诊疗指南》(2010年版)及《诸福棠实用儿科学》HFMD诊断标准。

1.2方法

1.2.1仪器及试剂 病毒检测用RNA提取试剂盒购自北京天根公司，一步法实时荧光反转录PCR扩增体系(Uotaq Probe 1-Step RT-qPCR System)购自美国PROMEGA公司， 罗氏Cobas z 480荧光定量PCR仪，台式高速离心机德国Eppendorf公司生产，探针、引物的合成由上海生工生物技术有限公司合成。EV71、CVA16荧光PCR试剂和EV通用型荧光PCR试剂采用上海之江生物科技有限公司。

1.2.2标本采集 病毒采样管使用北京友康基业生物科技有限公司提供，在患儿就诊当天由经培训护士用专用采样棉签，从患儿肛门轻轻插入，适度用力弧型左右擦拭数下，拔出后，迅速将棉签放入病毒采样管中，采样管外表贴上患者条码号码。2 h内送实验室，-20 ℃低温保存，2 d内用荧光PCR法检测EV通用型、EV71、CVA16核酸，对EV通用型阳性、EV71核酸阴性、CVA16核酸阴性的标本于-80 ℃低温保存。

1.2.3引物探针的设计与合成 从GenBank上下载不同年份和地区的CVA6、CVA10基因序列，用生物学软件进行同源性比较，在保守区polyprotein gene设计特异性引物和TaqMan探针。引物和探针由上海生工公司合成，探针5′端标记的荧光报告基团是FAM,3′端标记的荧光淬灭基团是BHQ，见表1。

1.2.4CVA6与CVA10荧光定量RT-PCR反应体系 总反应体系为50 μL，包括dNTPs(20 mmol/L) 1.3 μL上下游引物各0.20 μL探针0.20 μL，Mg2+(1 mmol/L) 0.18 μL，PCR核苷酸混合物10 μL，反转录聚合酶(200 U/μL) 0.3 μL，热启动Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 1.0 μL，酶稀释液0.7 μL，模板RNA 5 μL，最后补充焦碳酸二乙酯处理水(DEPC)至50 μL。反应条件：50 ℃ 15 min，95 ℃预变性 15 min，95 ℃变性5 s，退火/延伸:60 ℃ 45 s；40个循环。在每个循环退火延伸结束时检测荧光信号，荧光模式设为FAM/BHQ双标记模式。

1.2.5荧光定量结果判读 在罗氏Cobas z 480荧光定量PCR仪上进行检测。荧光通道检测选择：选用FAM通道。结果判断：检测Ct值，≤38为阳性，>38～40时重复检测一次，若依旧在此范围则为阴性。

表1 CVA6、CVA10荧光定量PCR引物和探针序列

F:正向引物；R:反向引物；P：荧光基因

1.2.6基因测序 随机选取各5份荧光定量RT-PCR检测病毒的阳性标本，方法按照本课题组以前的方法进行[7]，委托上海生工生物工程有限公司进行基因测序，进一步验证所建方法的准确性。

2 结 果

2.1HFMD年龄性别分布情况 2015年共收集607份临床诊断为HFMD的标本，患儿发病年龄1月至10岁，平均(2.7±1.2)岁，0～3岁组病例最多，占56.84%。男359例，女248例，男女比例1.45∶1，其各型EV在男女间差异均无统计学意义(χ2=5.939,P=0.676)，见表2。

表2 607例PCR荧光检测EV在性别分布情况(n)

表3 607例标本PCR荧光检测EV结果

2.2临床EV荧光定量PCR检测情况 在607份临床标本中，EV通用型的阳性为361例，检出率为59.47%；其中EV71 44例(7.25%)；CVA16阳性69例(11.37%)；EV71与CVA16同时阳性1例(0.16%)，CVA6阳性11例(1.81%)，CVA10阳性71例(11.70%)，其他血清型EV 164例(27.02%)。在阳性构成比中以CVA10 、CVA16、EV71为主，还有45.43%未明确的其他型EV，见表3。

2.3不同年龄的病原学检测结果 贵阳地区2015年HFMD 不同年龄组EV阳性检出率差异无统计学意义(χ2=4.566，P=0.603)；不同年龄组之间病原体型别构成比差异无统计学意义(χ2=37.018，P=0.189)。 CVA6、CVA10以1～2 岁年龄组为主，分别占各病原体型别总数的54.55%(6/11) 和30.99%(22/71)，同时发现EV71+CVA16及CVA6+CV10的混合感染各1例，见表4。

表4 不同年龄的病原学检测结果(n)

2.4测序验证 为确认CVA6和CVA10检测结果，从上面阳性的样本随机抽取5例，使用自行设计的CVA6和CVA10特异性引物对标本进行验证，证实RT-PCR的测序结果与特异性引物检测结果一致。

3 讨 论

除了EV71和CVA16之外，非EV71非CVA16的EV不断引起HFMD的暴发流行逐渐引起人们关注，近年来CVA10、CVA6和CVA3等多种也逐渐演变成为HFMD的常见病原体[1-10]。我国在HFMD监测中发现HFMD的病原体主要是EV71和CVA16，因此目前市场提供的HFMD病原检测商品试剂盒主要是针对EV71和CVA16鉴定，在常规的病原学核酸检测除用EV通用引物进行检测外，只进行EV71和CVA16的分型检测。用实时荧光定量PCR检测方法，具有更高的灵敏度和特异度，操作简便快捷，是一种快速可靠又经济有效的核酸扩增分子检测方法，易推广。

本研究运用实时荧光PCR技术，采用CVA6、CVA10高度特异的引物和荧光标记探针建立检测CVA6、CVA10的方法，同时用测序的方法对其阳性的样本进行验证结果相符，采用获得国家注册批准的商品试剂盒检测EV71、CVA16。对贵阳地区2015年5-6月607例临床HFMD病例进行核酸检测，发现病原体为其他EV为主的检出率为59.47%，其次CVA10占11.70%，CVA16占11.37%；EV71占7.25%，CVA6占1.81%，同时检出EV71+CVA16及CVA6+CVA10各1例。其检测数据与贵阳地区2010年报道[11]、2011年报道[12]及2013年报道[7]相比变化不大。本次检测中以CVA10为主，可能与每年的交叉流行有关。通过近年来对本地区EV病原监测，说明本地区的HFMD病原体主要是非EV71、非CVA16型的其他型EV感染，对这些未分型EV进一步分型鉴定，将有助于全面了解本地区HFMD的病原谱，同时有助于分析是否存在非EV71、非CVA16的其他优势病毒型别，为HFMD防控工作提供明确的病原学依据。

在本研究中CVA6与CVA10在男女性别构成分布上差异无统计学意义(P>0.05)，在年龄构成主要分布上CVA10在3岁以下而CVA6更集中在2岁以下，有报道表明，CVA6型病毒感染多见于1～2岁患儿，相比EV71和CVA16感染患儿平均年龄要小，这意味着该病毒的感染可能会引起更多的并发症[13]，提示在日常监测工作中应重视CVA6 病毒引起的HFMD。本研究及以往研究均提示贵阳地区HFMD中存在EV71、CVA16共感染及CVA6、CVA10型EV共感染现象[14]，有报道显示EV71和CVA16混合感染更易导致中枢神经系统并发症，加重危害[15]，因此应加强共感染在HFMD流行中作用的监测研究。

CVA6和CVA10是单股正链RNA病毒属于人类肠道病毒(HEV)，HEV按血清型分为脊髓灰质类病毒(poliovirus,PV1～3型)、CVA型(CVA1～22和24型)、CVB型(CVB1～6型)、埃可病毒(ECHO1～7、9、11～27、29～33型)及新型EV。在HEV-A所引起的疾病中，以HFMD最为常见。近年来国内外报道CVA6、CVA10及其他EV流行的文献不断增多，CVA6引起的HFMD约有56%的病例会形成大于1 cm的大疱疹、有硬痂，导致脱甲症的发生，进而发生重症HFMD。

临床医生对CVA16、EV71引起的轻症及重症HFMD了解较多，能够及时、准确诊断，但对于CVA6、CVA10等引起的HFMD临床表现认识不足，所以应加强HFMD病原学监测，及时掌握流行型别，并对医务人员及家长进行宣传培训。

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