尼泊金酯作为防腐剂在芽孢杆菌中的应用

陈伟+周荣华+廖先清+刘芳+张光阳+饶犇

摘要：研究了尼泊金酯作为防腐剂对苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）芽孢萌发的抑制作用和对伴孢晶体的影响。结果表明，尼泊金乙酯对苏云金芽孢杆菌芽孢萌发有较强的抑制作用，在0.05%低剂量下即可有效抑制芽孢的萌发。SDS-PAGE分析和生物测定表明，尼泊金乙酯对伴孢晶体无显著损伤作用，在0.10%条件下放置3周，发酵液毒力还保持在85%。

关键词：尼泊金酯； 防腐剂； 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）

中图分类号：TS202.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）24-4782-02

尼泊金酯是一种广谱性高效食品防腐剂，国际上广泛应用于调味品、糕点馅料、槟榔、乳制品、豆制品、肉制品、饮料、鱼类制品、果蔬等食品的防腐保鲜[1-5]。尼泊金酯及其钠盐系列产品有尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯及尼泊金甲酯钠、尼泊金乙酯钠、尼泊金丙酯钠、尼泊金丁酯钠，均有良好的防腐效果[6-9]，具有防止发酵、抑制细菌增殖和杀菌能力，能够钝化酶的活性，阻止微生物新陈代谢的某些环节，在一定浓度下对一些微生物的生长有抑制或者杀灭作用。在芽孢杆菌的水剂悬液中加入适当的尼泊金酯作为防腐剂，既可以阻止二次发酵，也能抑制一些杂菌的生长，从而维持菌悬液的稳定性。本试验研究尼泊金酯作为防腐剂对几种常用的芽孢杆菌水剂产品的作用，为后续产品开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株：湖北省生物农药工程研究中心研究室分离和保存的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。培养基：LB培养基（蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g）；发酵培养基（淀粉10 g，豆粕10 g，酵母粉5 g，玉米浆5 g，pH 7.2）。药品：尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、山梨酸钾、苯甲酸钠均购自国药公司。

1.2 方法

发酵：将苏云金芽孢杆菌接种至LB培养基，培养12 h后接种至发酵培养基，当菌体形成芽孢和晶体后，4 ℃保存备用。

尼泊金酯处理芽孢：将一定量的尼泊金酯加入装有10 mL的LB培养基的试管中，以未加尼泊金酯的试管作为对照。以1%比例接种各种芽孢杆菌的菌悬液，摇匀后30 ℃培养。每隔一段时间检查芽孢的萌发情况；对芽孢没有萌发的培养液稀释涂平板，分析芽孢是否被杀死。

尼泊金酯处理苏云金芽孢杆菌晶体：用天平称取一定量伴孢晶体悬浮于1 mL无菌水中，加入尼泊金酯，以未加伴孢晶体作为对照，振荡后30 ℃放置，进行SDS-PAGE测定。

尼泊金酯防腐防霉试验：将一定量的芽孢杆菌发酵液装入塑料瓶中，分别加入一定的尼泊金酯，45 ℃下放置，定期镜检杂菌生长，观察发酵液气味变化，测定发酵液的毒力以及芽孢的情况。

生物测定：以经验致死中浓度作为参照，将各处理发酵液以1.8倍稀释成不同浓度菌悬液，晾干。以1龄末棉铃虫作为供试昆虫，每个处理重复3次，每次接种30头，另置清水对照，25 ℃培养，处理4 d检查死、活虫数，计算LC50。

2 结果与分析

2.1 尼泊金酯对芽孢杆菌芽孢的抑制作用

由表1可知，尼泊金乙酯在0.05%的剂量下 14 d内可以抑制芽孢的萌发；在0.10%的剂量下30 d内可以抑制芽孢的萌发。尼泊金丙酯则在0.05%的剂量下7 d内可以抑制芽孢的萌发，0.10%的剂量下14 d内可以抑制芽孢的萌发。作为对照，苯甲酸钠在0.05%的剂量下7 d内可以抑制芽孢的萌发，0.10%的剂量下14 d内可以抑制芽孢的萌发。表明尼泊金乙酯对芽孢萌发的抑制作用较好。

为明确尼泊金乙酯是否将苏云金芽孢杆菌杀死还是只是抑制芽孢萌发，将上述用尼泊金乙酯处理28 d的芽孢用无菌水反复洗涤离心多次，除去其中的尼泊金乙酯，将洗涤好的芽孢稀释涂平板，30 ℃培养24 h。1 d后，芽孢萌发，说明尼泊金乙酯并未杀死芽孢本身；涂片和显微镜观察，芽孢经过处理后，萌发产生的芽孢及晶体形状没有发生改变，且芽孢与晶体的数量相当，表明尼泊金乙酯未使苏云金芽孢菌株发生变异。接着考察尼泊金乙酯对苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的作用，SDS-PAGE表明尼泊金乙酯对晶体无损伤作用。

2.2 尼泊金乙酯的防腐防霉能力

在前期研究尼泊金乙酯对苏云金芽孢杆菌芽孢及其伴孢晶体基础上，于50 ℃条件下放置，7 d后显微镜检查，除发酵液空白对照外，未添加尼泊金乙酯的发酵液表面出现较多霉菌，而添加0.10%剂量尼泊金乙酯的发酵液未污染杂菌；14 d后，未添加尼泊金乙酯的发酵液已完全污染，而添加0.10%剂量尼泊金乙酯的发酵液正常，無污染出现；28 d后，未添加尼泊金乙酯的发酵液已发臭，镜检全部是霉菌和杆菌等杂菌，而处理过的发酵液正常，无异味散出。

2.3 尼泊金乙酯作为防腐剂Bt发酵液毒力稳定性

生物测定添加尼泊金乙酯的苏云金发酵液在50 ℃条件下的毒力变化情况。结果表明，添加0.05%尼泊金乙酯的发酵液毒力稳定性一般，50 ℃下放置7 d后毒力保持率为80%，14 d后还有50%，21 d后则只有30%；而添加0.10%尼泊金乙酯的发酵液毒力稳定性非常好，50 ℃下放置7 d后毒力保持率为95%，14 d后还有90%，21 d后则只有85%。

3 小结与讨论

本研究结果表明，尼泊金乙酯在0.10%的剂量下可在30 d内有效抑制苏云金芽孢杆菌芽孢的萌发，但未杀死芽孢，有效防止了其二次发酵；SDS-PAGE分析表明，尼泊金乙酯对伴孢晶体并无明显损伤作用，且毒力保持良好，是良好的苏云金芽孢杆菌防腐剂，可以一定程度上代替苯甲酸钠。

参考文献：

[1] 邹玉萍，夏文水.尼泊金酯对蒸煮袋熟鱼防腐保藏[J].食品与生物技术学报，2009，28（2）：167-171.

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