樱桃谷鸭I亚群腺病毒PCR方法的鉴定

刘新勃（山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊 261061）孙 嘉 吴少鹏 鞠孜敬（山东农业大学 山东 泰安）唐德宏（山东省泰安市动物疫病预防控制中心）

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)是全世界家禽和野禽常见的具有传染性的病原。许多腺病毒可在健康禽类体内复制，却不表现感染症状或只是引起轻微的病症，但发生混合感染或其它一些因素影响时，也会表现出较严重的发病症状，甚至引起死亡。禽腺病毒属中的一类毒株本身就具有较强的致病性，如火鸡出血性肠炎病毒(Hemorrhagic enteritis virus, HEV)、产蛋下降综合征病毒(Egg drop syndrome virus, EDSV)等，这些病毒本身就是原发病原[1]。根据禽腺病毒抗原性的差异，将其分为三个群：I亚群FAdV具有共同的群抗原，根据中和试验可将其分为12个血清型，Zsak等利用RFLP技术又将I亚群FAdV划分为A-E 5个基因型。I亚群FAdV呈世界性分布，各年龄段家禽均易感。临床上，病毒在鸭、鹅、鸡体内普遍存在，可引起包涵体肝炎、心包积液、肌胃糜烂等病变，且能垂直传播，污染鸡胚[2]。大多数I亚群FAdV的致病作用还位完全确定，但FAdV-1株能引起鹌鹑支气管炎，FAdV-4株是心包积水综合征的主要原因。Ⅱ、Ⅲ亚群腺病毒主要包括HEV和EDSV[3-5]等。目前，EDSV被定义为鸭腺病毒1型(Duck adenovirus 1, DAdV 1），对产蛋期成年家禽的产蛋率有较大影响。1982年从一只番鸭体内分离得到一株I亚群腺病毒，该毒株与鸡和火鸡体内分离到的毒株差异较大，被归为鸭腺病毒2型(Duck adenovirus 1, DAdV 2)[6]。

FAdV分布广泛，随着家禽养殖业的不断发展，家禽饲养基数的不断增加，FAdV每年的感染数量都在增加，尤其是近两年以包涵体肝炎和心包积液为特征的FAdV的发病情况日益严重[7,8]。PCR已被广泛应用于I亚群FAdV的检测，用病毒六邻体基因做引物可区分A-E种并定位病毒的种内血清型。本研究为采用PCR检测方法探究山东泰安地区鸭体内I亚群FAdV的感染情况，这一探索将便于该病原的检测和疾病的防控。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品 样品来自山东地区的病死樱桃谷鸭肝脏、脾脏共计54份，樱桃谷肉种鸭场的死胚48份。

1.1.2 主要试剂 Tris 平衡酚购自Solarbio，琼脂粉购自Biowest，2×Taq Master Mix（含Taq DNA Polymerase，dNTP，优化的缓冲体系）购自诺唯赞生物科技有限公司，pUMD19-T载体购自Thermo Fisher Scientific，Trans 5α感受态细胞购自Takara，其它试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物信息 根据已发表的I亚群FAdV基因序列及文献报道，选取两对引物，由上海生工生物工程有限公司合成。FAdV-H1：5’-TGGACATGGGGGCGACCTA-3’；5’-AAGGGATTGACGTTGTCCA-3’，预计扩增目的片段长度为1200bp。FAV-H2：5’-AACGTCAATCCCTTCAAC CACC-3’；5’-TTGCCTGTGGCGAAAGGCG-3’，预计扩增目的片段长度为1300 bp。

1.2.2 病鸭剖检 对临床表现出明显发病症状的肉鸭进行临床剖检。

1.2.3 病毒基因组DNA提取 采用传统苯酚氯仿法提取I亚群FAdV的基因组DNA。

1.2.4 PCR体系及条件 PCR反应体系为25µl，2×Taq Master Mix 12.5µl，上下游引物各0.5µl，ddH2O 10.5µl。PCR反应程序为95℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。

1.2.5 PCR产物的鉴定 取7µl PCR扩增产物进行电泳，根据扩增产物的大小进行初步鉴定，琼脂糖凝胶浓度为1%。利用凝胶回收试剂盒回收与目的片段大小相符的特异性片段，将基因片段连接至pUMD19-T载体，连接体系为：T4 DNA Ligase 1µl，pUMD19-T Simple Vector 1µl，10×Ligase Buffer 1µl，回收的PCR产物7µl。16℃过夜连接后转化入Trans 5α感受态细胞。挑取单个转化菌落于LB培养液(Amp+)过夜培养，PCR鉴定阳性克隆送至铂尚生物技术有限公司进行测序。

1.2.6 I亚群FAdV部分核苷酸序列分析 将测得的基因片段序列与I亚群FAdV参考株基因组序列比对，进行同源性比较和基因进化树分析。用于核酸序列分析所用的I亚群FAdV各毒株名称、血清型、GenBank登录号、登录时间、分离地区见附表。

附表I 亚群FAdV参考株信息

2 结果与分析

2.1 剖检结果

心脏膨大疲软，心肌内外膜出血，有心包积液；肝脏肿大，质脆；肺部坏死，表面附有胶冻样物质；胆部肿大，呈墨绿色；胰腺出血；腺胃膜容易脱落；脾脏呈暗红色，肿大，表面有针尖大小的白色坏死点；肠道有出血；肾部表面有尿酸盐沉积(图1)。

图1 眼观病变

2.2 PCR检测结果

提取病毒DNA，PCR扩增后经1%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外凝胶成像仪下可观察到，FAdV-H1引物扩增出约1200bp左右的条带，FAdV-H2引物条带大小约为1300bp左右(图2)。PCR检测结果显示，病料中I亚群FAdV阳性率为9.3%(5/54)，未从鸭死胚中检测出I亚群FAdV感染。

2.3 I亚群FAdV部分基因序列同源性分析

随机选择PCR阳性样品进行克隆测序。序列分析发现，检测到的FAdV片段和血清4型、血清10型有较高的同源性，与两株在中国分离到的血清4型I亚群FAdV参考株(KU569296、KU981115)的同源性最高为97.7%。FAdV的部分基因片段与其它血清型的I亚群FAdV同源性较低(图3)。由此可见，该FAdV毒株为血清4型I亚群FAdV。

图2 部分送检样品中I亚群FAdV的PCR检测结果

图3 I亚群FAdV部分基因片段同源性分析图

2.4 I亚群FAdV部分基因片段系统基因进化树

基因进化树显示，检测到的FAdV与两株中国的血清4型I亚群FAdV参考株(KU569296、KU981115)位于基因进化树同一分支上，与印度的血清4型I亚群FAdV位于同一次级分支上，亲缘关系较近(图4)。

图4 I亚群FAdV系统进化树

3 讨论

3.1 I亚群FAdV的控制

I亚群FAdV具有较强的抵抗力，通过严格的消毒能够消灭环境可控密闭鸡舍内的I亚群FAdV，由于I亚群FAdV可以通过种蛋垂直传播，消除商品鸡群中腺病毒存在很大困难，并且，从SPF鸡获得的经验表明，病毒水平传播的方式也是制约商品鸡群控制I亚群FAdV感染的一大问题[9]，所以，控制原种鸡的腺病毒感染是实际可行的方法。

3.2 FAdV发病症状和病变

（1）I亚群FAdV发病除引起包涵体肝炎、心包积水综合征、肌胃糜烂等典型症状外，还对产蛋量、饲料转化率和生长有一定影响，并且可能与呼吸道症状和腱鞘炎的发生有很大关联。一些学者报道，某些I亚群FAdV毒株感染可使产蛋降低10%或者影响蛋壳质量。国内外已有一些关于I亚群FAdV感染导致饲料转化率降低的报道，研究发现，将自然感染的家禽在实验室条件下饲养会出现生长迟缓的现象[10,11]。家禽发生呼吸道疾病时，经常可从呼吸道中分离到I亚群FAdV，从发生腱鞘炎家禽的病变部位也分离到I亚群FAdV，呼吸道疾病和腱鞘炎的发生可能与I亚群FAdV有关。（2）在包涵体肝炎病例中，肝脏苍白、质脆、肿胀，肝脏和骨骼肌有出血点和出血斑，肝脏细胞内出现包涵体为主要的病理变化。在心包积水综合征病例中，心包腔中有淡黄色清亮积液，肺水肿，肝脏肿胀和变色，肾肿胀并伴有肾小管扩张，心脏和肝脏出现多发性局灶性坏死灶。本研究在进行临床剖检时，发现心包积液为主要的眼观病变，其它病变并不明显。

3.3 PCR对FAdV的检测

（1）PCR方法准确，灵敏，具有很好的特异性。目前对I亚群FAdV的检测主要采用PCR、ELISA实验[12-15]，对于有血凝性的病毒如EDSV通过HA/HI试验检测，但敏感性不高，我们采用PCR方法从鸭群中分离I亚群FAdV，结果证明I亚群FAdV在泰安地区鸭群有流行，但是大群健康鸭带毒不发病。（2）本研究对2017年自泰安地区采集的病死鸭病料进行FAdV的分离鉴定，同时也根据剖检症状检测了其它常见具有传染性的病原体，包括H5、H7和H9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)、鸭圆环病毒(Duck circovirus, DuCV)等，其它病原有阳性结果，但未检测到I亚群FAdV与其它病毒同时感染的情况。另外，我们对PCR扩增的片段测序后进行序列比对和同源性分析发现，检测到的FAdV主要为血清4型，也检测到1例血清8b型，确定了用于PCR扩增的引物的准确性和特异性。

3.4 FAdV的流行及防治

有研究对I亚群FAdV进行了流行病学调查，发现近几年FAdV-2，FAdV-8，FAdV-10，FAdV-12四个血清型为优势血清型，选择这四个优势血清型的毒株制成多价油乳灭活苗，疫苗免疫5日龄白羽肉鸡后能诱导较高的抗体水平产生，在肉鸡的生长期内可抵抗I亚群FAdV的攻击[15]。在国内，I亚群FAdV还没有商品化的疫苗用于临床，使用感染禽的肝脏制成组织灭活苗对种鸡进行免疫，使后代获得了较高水平的母源抗体，对雏鸡抵抗I亚群FAdV的感染起了很好的预防作用。应用本土分离株经病毒扩大培养，或利用感染禽的肝脏制成油乳剂灭活疫苗，免疫肉鸡后能增强机体体液免疫和细胞免疫，对种鸡进行免疫后，能增强后代雏鸡的母源抗体水平，对血清型复杂的I亚群FAdV的防控具有十分重要的意义。

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