生长激素受体基因敲除小鼠模型

王小双，米艾，孙捷，王丹，曾丽，冉丽媛*，吴英杰*

(1. 大连医科大学重大疾病基因工程模式动物研究所，基因工程模式动物国际联合研究中心，辽宁 大连 116044； 2. 吉林大学附属第一医院干部病房，长春 130000)

1966年，Zvi Laron首次发现一种常染色体隐性遗传的侏儒症并将其命名为Laron综合征，该类患者身材矮小、青春期延迟、反复低血糖、低血清胰岛素样生长因子1(IGF-1)、高血清GH；进一步研究发现该疾病是由于GHR基因突变导致GH功能缺陷[1]。但受病例数量和科研手段限制，这种GH功能缺陷对机体生长代谢的长期影响及相关疾病治疗与预后均未得到充分研究。

如今，基因编辑技术在研究疾病发生发展、转归治疗等方面发挥日益重要的作用。科学家基于Cre/LoxP等技术建立了多种基因敲除模型以研究特定基因在特定组织或各种疾病发生发展中的作用机制。小鼠Ghr基因由15号染色体上共计10个外显子编码[2-3]，其中外显子4编码 GH结合区，因此也成为Ghr基因编辑的靶标。目前除了全身Ghr基因敲除小鼠外，肝、肌肉、脂肪等组织特异性Ghr基因敲除小鼠模型也逐步产生，用于分析GH相关信号通路在机体生长及代谢中的作用。

1 全身敲除Ghr基因小鼠模型

1997年Zhou等[4]构建了第一只全身敲除Ghr基因小鼠模型(GHR-/-)，这是最早用于研究GH功能的实验动物模型，迄今已发表相关论文70余篇。

GHR全身敲除对小鼠生长发育产生严重影响。GHR-/-小鼠生长缓慢，出生时体重与对照组无明显差异，从3周龄开始，其身长、体重均小于对照组，且随年龄增长差距越发明显[4]。尽管雄性 GHR-/-小鼠体重较低，但其脂肪占比明显增高，雌性GHR-/-小鼠无此现象[5-6]。随年龄增加，GHR-/-小鼠(90周龄)体重有所降低[7]，这提示GHR-/-小鼠脂肪占比增加存在性别和年龄依赖。

由于缺少GH刺激和IGF-1负反馈调节，GHR-/-小鼠血清GH显著增加，血清IGF-1含量减少[4]，血清瘦素[8]及脂联素[9]水平均有升高。GHR-/-小鼠胰岛素水平较低，但胰岛素敏感性增加[5]，血胆固醇及低密度脂蛋白含量低[8]，寿命延长[10-11]。GHR-/-小鼠更容易被高脂饮食(High fat diet，HF)诱导产生肥胖，但胰岛素敏感性仍优于对照组[12]。这表明，当脂肪组织充分发挥储脂功能时，肥胖对机体健康的损伤可能有所下降，也说明体内脂质含量不应是衡量健康与否的核心标准。

与Laron综合症患者相似，GHR-/-小鼠性成熟较晚，生育能力降低[13-14]，平均每胎生仔2.71只，仅 GHR+/-小鼠的1/3(6.57只/胎)，且死亡率较高，这可能与胎盘功能和哺乳能力不足有关[4]。GHR-/-小鼠在生长发育、生殖及代谢方面的改变可为临床探究GH功能失调相关疾病提供充足的理论依据。

2 肝特异性敲除Ghr基因小鼠模型

Fan等[15]在2009年构建了一种GHR-Flox小鼠，并与Alb-Cre工具鼠杂交获得肝特异性敲除ghr小鼠模型(GHRLD)。GHRLD小鼠血清IGF-1减少了95%，且伴随严重高GH血症(升高4倍)；但在几乎完全缺失内分泌 IGF-1的情况下，其身长体重并未受影响，仅出现肝重显著增加而肾重减少。肝特异性敲除Igf-1也会导致高 GH血症及血浆中IGF-1水平下降，但对小鼠生长并无显著影响[16-18]，这说明肝源性 IGF-1并非小鼠生长所必需，循环中高水平GH与GHR的直接作用或机体其他组织通过自分泌、旁分泌产生的少量 IGF-1才是机体生长的关键。另外，GHRLD小鼠6周龄时即出现葡萄糖耐量异常和胰岛素抵抗(IR)，8周龄时自发形成脂肪肝[15]，说明肝GHR可能参与介导了GH非IGF-1依赖性的胰岛素分泌及糖脂代谢调节。

2014年， List等[19]将 Alb-Cre工具鼠与其新构建的 GHR-Flox小鼠杂交获得新型肝特异性敲除Ghr小鼠模型(LiGHRKO)。与GHRLD小鼠不同，LiGHRKO小鼠脂肪减少，肝重增加，身长体重均明显低于对照组。其中，雄性 LiGHRKO小鼠出现脂肪肝，而雌性小鼠肝无明显变化。值得注意的是，在转录水平， LiGHRKO小鼠除了肝中Igf-1表达明显降低外，其余组织中Igf-1表达均明显升高[19]。由此可见，肝作为循环内IGF-1的最大来源，其GHR缺失严重影响 GH依赖于 IGF-1的生长发育、血糖调节及肝脂质代谢过程。非酒精性脂肪肝(NAFLD)作为代谢综合征累及肝的病理表现，影响着全球三分之一的人群。据研究，GH受损人群NAFLD发病率更高[20]。循环水平低GH或肝GH/IGF-1轴功能受损均与 NAFLD发生相关。上述两种模型为深入认识 NAFLD发病机制及其临床个性化靶向治疗提供了良好的实验工具。

3 骨骼肌特异性敲除Ghr基因小鼠模型

Mavalli等[21]在2010年构建了骨骼肌特异性敲除Ghr小鼠模型(ΔGHR)。骨骼肌Ghr缺失导致骨骼肌纤维比例显著失调，Ⅰ型肌纤维明显减少，Ⅱ型肌纤维明显增多，骨骼肌肌核减少，肌力降低并产生胰岛素抵抗[21]。同时，缺失Ghr的肌原细胞内磷酸化的胰岛素底物1表达上调，磷脂酰肌醇激酶及细胞外调节蛋白激酶的磷酸化水平均显著下调，这揭示了ΔGHR小鼠产生胰岛素抵抗的机制。

同肝Ghr敲除小鼠模型类似，肌肉敲除Ghr对小鼠生理代谢的影响也因Cre鼠的不同而各有差异。利用Mef-2c-73k-Cre构建的ΔGHR小鼠脂肪增多导致体重增加，且产生高血糖和高血脂[21]；而利用 MCK-Cre构建的mGHRKO小鼠则恰好相反，表现为消瘦、更优的胰岛素敏感性和糖耐量[22]。HF喂养后，mGHRKO小鼠脂肪肝病变较轻，胰岛素敏感性较好，骨骼肌摄糖量及氧化呼吸率增加。HF处理的mGHRKO小鼠蛋白激酶 B磷酸化水平上调，这可能是其对胰岛素更敏感的原因[22]。2015年， List等[23]利用 Ckmm-Cre鼠获得新型骨骼肌和心肌特异性敲除Ghr小鼠模型(MuGHRKO)。研究发现雄性 MuGHRKO小鼠体重与脂肪重量均略有增加，血糖与血胰岛素水平较低；而雌性MuGHRKO小鼠体重与脂肪组织重量则显著减轻[23]。这与LiGHRKO小鼠肝脂肪变性仅限于雄性小鼠的发现类似[19]，提示Ghr基因在不同性别中的表达及GH在不同组织的功能发挥具有二态性，从而对GH的临床研究及应用起到一定指导作用。

4 脂肪特异性敲除Ghr基因小鼠模型

List等[24]在2013年利用aP2-Cre与 GHR-Flox小鼠杂交获得脂肪特异性敲除Ghr基因小鼠模型(FaGHRKO)。FaGHRKO小鼠除了肥胖和脂肪明显增多外，在血糖、胰岛素、葡萄糖耐量、胰岛素敏感性及脂肪细胞因子水平并无明显改变。有研究报道Ap2基因不仅表达于脂肪组织，在非脂肪组织如心脏内皮细胞、骨骼肌周围毛细血管、巨噬细胞和胚胎发育过程中亦有表达[25]，这种非特异性表达可能对实验结果产生干扰。

脂肪组织不仅是机体重要的储能和内分泌器官，也是间充质干细胞的最大来源，探索GH对脂肪的调控和脂肪源性干细胞增殖分化能力的影响可为临床干细胞的体外培养和移植提供新思路。Adipoq-Cre是另一种在脂肪组织中特异表达 CRE酶的工具鼠。相较于ap2-Cre，其介导的基因重组更加特异[26]。利用Adipoq-Cre构建新型脂肪特异性敲除Ghr小鼠模型，探索 GH相关信号通路对脂肪细胞分化、脂质合成分解等代谢过程的调控及其与肥胖症、脂肪肝等脂代谢紊乱疾病的关系是很有必要的。

5 巨噬细胞特异性敲除Ghr基因小鼠模型

肥胖常伴有脂肪组织中巨噬细胞(Mφ)的浸润、积累和激活[27]。研究表明，在含有Mφ的条件培养液中培养前脂肪细胞，其成脂分化能力更强，过氧化物酶体增殖物激活受体γ的转录水平升高，且Mφ这种促分化作用必须在 GH刺激下才能发生[28]。为了探索 GH对Mφ分泌因子的直接作用和对饮食诱导肥胖的影响，2010年 Lu等[29]将LysM-Cre鼠与Ghr-Flox小鼠杂交，获得Mφ敲除Ghr小鼠模型(MacGhrKO)。 HF处理8周，MacGhrKO小鼠产生明显的糖耐量异常， HF处理18周，MacGhrKO小鼠糖耐量损伤更明显，并产生了胰岛素抵抗。同时， MacGhrKO小鼠脂肪组织内胰岛素信号通路也被显著抑制[29]。

Mφ在脂肪组织中有M1和M2两种表型，其中M1数量增加与炎症发生密切相关。在肥胖患者脂肪中存在大量Mφ浸润并高表达M1标记物，分泌促炎细胞因子[30]。HF 处理18周后， MacGhrKO小鼠脂肪内 Mφ总数增加，M1比例升高且炎症因子表达显著增多。这表明在 HF条件下，Mφ缺失GH作用会导致脂肪组织中Mφ浸润增加和明显的炎症反应[29]。该模型证实GH参与肥胖与慢性炎症的发生机制。

6 β细胞特异性敲除Ghr基因小鼠模型

2011年， Wu等[31]利用 RIP-Cre鼠构建了β细胞特异性敲除Ghr基因小鼠模型(βGhrKO)。尽管Ghr全身敲除导致胰岛细胞显著变小[5]，但β细胞内敲除Ghr后对小鼠胰岛大小和胰岛素含量并无明显影响；HF处理24周后βGhrKO小鼠出现糖耐受不良及葡萄糖刺激的胰岛素分泌不足，组织免疫荧光分析发现其胰岛细胞增殖明显降低，这可能与细胞周期蛋白D2表达量降低有关[31]。

7 结语

GH相关信号通路在机体生长发育、糖脂代谢、免疫调节等方面发挥重要作用[32-35]。上述多种Ghr基因敲除小鼠模型是深入研究GH生理病理功能的良好工具。临床GH功能缺陷可发生于婴幼儿、儿童直至成年期的不同阶段，所引起或参与的代谢紊乱与发病年龄密切相关，导致的症状、对生长代谢的影响亦大不相同。不同时期发病的患者对环境及饮食因素的易感性也不尽相同[36]。儿童期 GH缺乏多由相关基因缺陷引起，如Laron综合征，对机体生长发育影响重大；而成人阶段GH功能紊乱隐匿且复杂，可与糖尿病、肥胖症、肝疾病及其他激素紊乱互为因果，也可与药物、创伤等外界因素相关[37]。因此，利用Ghr基因敲除小鼠模型解析GH对生长代谢的作用时，除了考虑组织特异性外，激素功能发生紊乱的时段特异性也尤为重要。

利用Cre-LoxP技术与时间特异性可诱导的基因敲除手段相结合，可使我们对体内特定基因或基因组合的认识增加另一个维度。可诱导性基因敲除手段包括：他莫昔芬、四环素等配体诱导[38-39]；表达CRE的腺病毒或慢病毒载体注射进行体外传送[40]、 RNAi介导[41]，以及由植物光感受器发展而来的光波诱导的蛋白质相互控制[42]，从而达到DNA重组的目的。该类技术已在越来越多的全身或组织特异性基因敲除中得以实践，如心脏[43-44]、肾[45]、脑[42]中特异性敲除基因等。已有报道成功构建出他莫昔芬诱导的心脏特异性Ghr敲除小鼠模型(iC-GHRKO)[39]，以研究不同生长阶段 GHR缺失的作用。故而开发可控、可逆转的定时、定点、定系(细胞谱系)的Ghr敲除小鼠模型，无疑是未来深入探索 GH/GHR功能机制的必然方向。

另一方面，和许多其他激素相似， GH对生长发育和机体代谢的调控功能发挥具有脉冲式分泌、性别二态性和昼夜节律等特点，在对此类模型研究结果的解读中不可忽视。另外，不同哺乳动物物种的代谢特征与其身体大小密切相关，因此，在对比基因敲除小鼠模型和临床观察结果时，有必要纳入分析因素。