干性记忆型T细胞及其在抗肿瘤研究中的进展

李 莉 陆小凡 赵焕英 计云霞 刘利锋 粟 斌

(艾滋病研究北京市重点实验室 首都医科大学附属北京佑安医院，北京 100069)

伴随CAR-T细胞疗法获得FDA批准正式上市以来，足以改变癌症治疗模式的过继免疫治疗(AIT)成为人们持续关注的热点。AIT目前大多采用分化终末期的效应T细胞，而且其疗效与过继转移T细胞的数量有关。研究表明中晚期T细胞回输后，其扩增及存活能力均不如早期T细胞，例如Klebanoff等〔1〕观察了中心记忆型T细胞(TCM)和效应型T细胞(TEM)分别输注于接种肿瘤细胞的小鼠模型，发现在体内TCM比TEM具有更持久的存活时长和更好的抗肿瘤效果。究其原因，TCM较TEM具有自我更新和分化为效应细胞的能力。那么，新近发现的干性记忆型T细胞(TSCM)，它们具有更强的增殖和自我更新能力，可能成为T细胞过继性免疫治疗一个新的亮点。

1 TSCM的表型及功能特点

1.1TSCM的发现 根据细胞表面淋巴结归巢标志(CCR7或CD62L)和蛋白酪氨酸磷酸酶CD45(CD45RA或CD45RO)的表达，记忆型T细胞可分为TCM、TEM〔2,3〕。以往研究认为，记忆型T细胞由初始T细胞在受到抗原刺激时分化产生，经由TCM，最终分化为TEM，但在2005年，美国宾夕法尼亚大学医学院Zhang等〔4〕在研究小鼠移植物抗宿主反应疾病(GVHD)时发现一群低表达CD44(CD44lo),高表达CD62Lhi及干细胞抗原,同时表达Bcl-2，CD122(IL-2和IL-15受体)的CD8+T细胞，这群细胞具有干细胞样的特点，被命名为“TSCM”。在2009年，Gattinoni等〔5〕在小鼠身上进一步证实了这群细胞的存在。直到2011年，这一个新的记忆型T淋巴细胞亚群在人类外周血中被Gattinoni等〔6〕发现，因此，由于TSCM亚群的发现，传统的T细胞分化模式被打破，T细胞分化模式改变为：初始T细胞→TSCM→TCM→TEM。致此，TSCM被认为是最早期分化的，存在时间最长的记忆型T细胞。

1.2TSCM的表型特征 TSCM存在于小鼠、灵长类动物及人类。在人类外周血中，约占CD4+或CD8+T细胞的2%～4%，归巢于淋巴结。TSCM与初始T细胞具有相似的细胞表型，均具有CD45RA+CD45RO-CCR7+CD27+，但是，与初始T细胞不同的是，TSCM高表达CD95和CD122(IL-2Rβ)(两者均为TCM和TEM所表达的细胞表面标志)。人类TSCM还高表达BCL-2、CXCR3、CXCR4、LFA-1等T细胞分化标志物，而低表达CD38和CD31。

1.3TSCM的功能特征

1.3.1有分泌细胞因子的能力 TSCM具有与TCM和TEM相似的特性，即当再次遇到抗原刺激时，记忆型T细胞能够快速反应，发挥其效应功能。Gattinoni等〔6〕发现：CD8+TSCM细胞在抗CD3/CD28/CD2等多克隆刺激下，可以分泌肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素(IFN)-γ和白细胞介素(IL)-2等细胞因子，而初始T细胞则不具有这些特性，当再次遇到抗原刺激时保持相对稳定的状态。

1.3.2具有自我更新和多能分化的潜能 研究表明〔6〕：CD8+TSCM在IL-15存在下，连续培养10 d，约有60%的TSCM细胞保持CD45RA+的特征，即CD45RA+CD45RO-CCR7+CD62L+，而TCM仅有30%保持原细胞表型，即CD45RA+CD45RO+CCR7+CD62L+，因此，TSCM细胞比TCM细胞具有更强的自我更新的能力。同时还证实TSCM在抗CD3/CD28/CD2等多克隆刺激下，部分TSCM细胞逐渐表现为CD45RO表达上调，CD62L和CCR7的表达下调，进一步分化为TCM和TEM。TCM约占TSCM子代的50%,TEM约占4%，约有15%的TSCM细胞保持母代表型特征。Cieri等〔7〕观察TSCM在人骨髓移植的分化情况时，亦证实了TSCM可以进一步分化为TCM和TEM。所以，与TCM和TEM相比，TSCM具有再生、多能分化等干细胞特性，具有产生所有记忆型T细胞的能力。Klebanoff等〔8〕的研究亦证实了这一发现：将不同的T细胞亚群对小鼠进行输注，以肿瘤的缩减程度作为评判指标，T细胞分化程度和抗肿瘤效果之间存在着明显的负相关关系，即分化程度越低的T细胞亚群，其抗肿瘤效果越强大，TSCM>TCM>TEM。

1.3.3具有增殖能力 一个CD8+TSCM在IL-15存在的培养基中可以快速分裂成2个子细胞，其中，一个子细胞保持原母代细胞特性，另一个子细胞进一步向下分化为其他类型的T细胞(包括TCM和TEM等)。CD4+TSCM在IL-7的存在下具有相似的增殖能力〔9〕，因此，TSCM一部分保持静息状态，具有进一步增殖及分化的潜能。

2 TSCM与抗肿瘤作用及机体免疫

2.1TSCM的抗肿瘤作用 在小鼠的在体实验中，TSCM与其他类型的T细胞相比，具有自我更新的能力及更强的抗肿瘤能力〔5,6,10〕。这些特性的具备，使得TSCM疗法可以克服现有的免疫治疗缺点，如T细胞植入低下、持久性差及不能形成长久的免疫反应等。

Gattinoni等〔5〕证实，TSCM在小鼠腹腔过继性T细胞治疗的第二次诊疗中，可以分化成TCM和TEM亚群。Cieri等〔10〕证实在移植物抗宿主病小鼠模型中，TSCM被证实在淋巴结及非淋巴组织中，均具有植入、增殖等能力，且是初始细胞和TCM的10～100倍。值得注意的是，TEM已被用于临床试验中，但植入体的增殖及存活能力较差，无法在体内维持长时间的免疫应答。在NSG小鼠模型中，TSCM较初始T细胞和T细胞其他亚群更具自我复制和存活能力。

T细胞的增殖和存活能力与过继性T细胞治疗的抗肿瘤效率密切相关〔6〕。T细胞受体(TCR) 或嵌合抗原受体(CAR)基因工程是目前临床应用的针对靶标的特异性循环T细胞的技术。Gattinoni等〔6〕应用这一技术制备针对间皮素特异的记忆型T细胞的各亚群，以检测对于肿瘤模型的抵抗作用。间皮素特异TSCM、TCM、TEM细胞注射入严重免疫缺陷小鼠(NSG小鼠)的腹腔内。发现TEM介导的抗肿瘤能力最差，并伴有腹水等症状，与对照组相比，小鼠的生存率未见明显改观；TCM治疗较TEM治疗有效，提高了小鼠的生存率，但在治疗后的40 d内，小鼠均死于肿瘤的进展。与此明显相反的是，TSCM细胞在小鼠体内激发对肿瘤的抑制，除部分小鼠(2只)在2～3 w内死亡外，其余小鼠(6只)获得治愈或肿瘤明显缩小。移植TSCM细胞造成的小鼠晚期死亡的原因主要是由于移植物抗宿主反应所致的体重下降。由此可见，在小鼠模型中，过继性TSCM细胞治疗较TCM 和TEM细胞治疗具有更强的抗肿瘤能力和更好的治疗效果。而对骨髓移植患者的治疗研究发现，以TSCM为靶点的T细胞治疗方案可能具有比TCM和TEM更安全、有效的治疗效果〔11〕。在血液肿瘤中，TSCM细胞被认为是免疫记忆的决定因素之一，监测TSCM细胞的水平对血液肿瘤骨髓移植后的预后有重要意义〔12〕。

2.2TSCM与机体免疫 TSCM细胞在维持机体细胞免疫功能中亦具有重要作用〔13〕。长期的抗病毒治疗过程中，人类获得性免疫缺陷病毒(HIV)特异性CD8+TSCM介导的CTL反应有助于机体产生持久的体液免疫反应〔14〕。HIV慢性期感染患者CD8+TSCM细胞与疾病进展具有一定的相关性〔15〕。另外，TSCM细胞在其他感染性疾病中也充分显示了其在机体细胞免疫中的作用。对41种黄热病毒减毒疫苗的研究发现，黄热病毒特异性CD8+TSCM细胞可以稳定存在25年以上且仍具有再生能力〔16〕，由此可见，与TCM和TEM细胞相比，TSCM细胞具有更强的再生、抗病毒和抗肿瘤能力。然而，CD4+TSCM细胞极易被HIV病毒感染，其胞内HIV-1DNA含量虽不是最高，随着HIV治疗时间的延长，CD4+TSCM细胞逐渐成为HIV病毒贮存库的主要成员〔17,18〕，因此，检测HIV感染的CD4+TSCM细胞水平成为有效控制HIV感染的重要评价指标之一。

2.3TSCM细胞在肿瘤免疫治疗中的潜能 有两个基因治疗的临床试验对TSCM细胞在肿瘤免疫治疗中的可能性进行了探索，这些临床试验均以在体长时程T细胞改造为特点。实验者追踪了接受基因治疗者的1 700个T细胞克隆的命运，实验证实TSCM细胞在基因改造的干细胞融合后保持存在长达12年之久，对TSCM细胞的安全、功能、生存期等的验证，均说明了其具有临床应用的潜能〔11〕。Sabatino等〔19〕进行了临床级别的CD-19特异的CAR修饰的CD8+TSCM细胞治疗B细胞恶性肿瘤的实验，实验表明，CD19-CAR 修饰的CD8+TSCM 显示更强的代谢适应性，对急性淋巴细胞白血病移植瘤具有持久的抗肿瘤反应且反应稳定，这一实验为一期临床试验奠定基础。

虽然临床前动物实验已经证实TSCM细胞具有非常有效的抗肿瘤的作用〔5,6〕，但是，过继性TSCM细胞治疗距离临床应用尚有很长的路要走，需要跨过的障碍之一就是如何扩增得到足够数量的TSCM细胞，这方面的研究正方兴未艾。Cieri等〔10〕和Gattinoni等〔6〕分别用IL-7/IL-15 、Wnt/β-catenin通路中糖原合成 (GSK)-3β的抑制剂TWSl19联合IL-7/IL-21对体外人TSCM进行扩增，取得较好的效果；van der Waart等〔20〕干扰Akt信号通路获得具有MiHA-特异性、CCR7+CD62L+早期记忆型CD8+T细胞。我国在这方面也做了初步尝试，马星如等〔21〕用生长分化因子11(GDF11)对CD8+T细胞进行体外扩增，随着CD8+T 细胞数量的增加，相应的TSCM细胞数量也随之显著地增加，并在培养的第3周达到增殖高峰。这些有效的尝试，为TSCM细胞尽快应用于临床抗病毒和抗肿瘤的过继型性免疫治疗，提供了新的可行的技术手段和方法。

TSCM具有干细胞的特性，自我更新和进一步分化的能力。Biasco等〔11〕首次证实用于基因治疗的TSCM细胞是安全的，并具有持续性存活能力。随着TSCM体外扩增的技术和方法的成熟，以及CAR-T细胞疗法在国外临床应用及我国这方面的初步的尝试，基于TSCM的特点，将其应用过继性免疫细胞治疗，及基于CART技术将其应用于肿瘤治疗，将指日可待，从而开启免疫治疗及肿瘤治疗的新的篇章。