非酒精性脂肪性肝病动物模型研究进展

王春花,靳丽颖,王思萌

(牡丹江师范学院生命科学与技术学院,黑龙江 牡丹江 157000)

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指排除过量饮酒和其他明确的损肝因素所致的、以弥漫性肝细胞大泡性脂肪病变为主要特征的临床病理综合征,随着疾病发展可由单纯性脂肪变性,发展为非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、肝硬化、甚至肝细胞癌。随着人们生活水平的提高,生活习惯和环境等多种因素的改变,NAFLD患病率逐年上升并呈年轻化全球化趋势,全球NAFLD患病率为25.24%[1],在我国NAFLD已经替代乙型肝炎成为最常见的慢性肝病[2]。NAFLD发病机制尚不十分清楚,自1998年Day[3]首先提出“二次打击”学说之后,“二次打击”理论逐渐用来解释NAFLD和NASH的发病机制。学说认为“第一次打击”主要是指肝脏脂质的积累,甘油三酯积累并不能直接引起肝脏毒性,但游离脂肪酸过度积累导致了脂肪酸β氧化增加,产生活性氧簇(ROS),当ROS的生成超过机体的抗氧化能力时,出现氧化应激,导致炎症因子的产生增加,促进了细胞凋亡,对肝脏造成了“二次打击”。另外,2008年Jou[4]又提出了“第三次打击”的假说：脂肪变性、氧化应激和炎症交互作用,最终导致肝细胞坏死。理想的动物模型应完全模仿人类NAFLD全部表型,包括肥胖,胰岛素抵抗,肝炎,纤维化和癌变,但这种完全复制人类疾病特征的模型至今仍是空白。目前,研究者们为了研究NAFLD发病机制及开发有效药物,构建了不同发病特点的NAFLD模型。被用于构建NAFLD模型的动物主要有大鼠、小鼠、沙鼠、家鸭、家兔与小型猪等,其中小鼠和大鼠造模最为常见。因此,本文重点围绕大鼠与小鼠NAFLD模型的研究进展进行综述。

1 饮食模型

主要通过饲喂高脂肪,高胆固醇和高糖高淀粉等饲料诱导大鼠,小鼠建立模型,模型表现为血清甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、游离脂肪酸(Free Fatty Acid,FFA)和低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL)等水平显著增高,肝功能酶的活性升高,丙二醛、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶等肝脏氧化应激指标改变,肝细胞脂肪浸润,出现大泡样脂滴,偶尔可见点状坏死或者炎症。此类模型常被用于NAFLD发病机制的研究。

1.1 高脂饮食(High-fat diet,HFD)模型 HFD诱导的NAFLD疾病模型主要通过饲料中添加猪油等脂肪成分,增加模型动物游离脂肪酸的摄取或合成,此类模型在发病机制上与人类NAFLD最为相似。Aragno等[5]添加15%猪油和4%胆固醇饲喂大鼠15周,体重,肝指数,肝脏TG,TC和FFA等水平显著增高,肝组织出现脂肪变性。Ito M等[6]利用HFD饮食诱导C57BL/6J小鼠,10周表现肥胖,高胰岛素血症,12周出现葡萄糖不耐症,19周可观察到肝脏脂肪变性,36～50周才观察到不明显的纤维化。

1.2 果糖模型 果糖模型是通过饮水或饲料中添加果糖,长期适量果糖摄入可导致肠道菌群过度生长和肠渗透性增加,门静脉内毒素浓度增加,激活Kupffer细胞而加重肝脏炎症发生。果糖添加可促进营养过剩饮食模型动物肝脏纤维化,炎症等NASH表型的发生。Mamikutty N和张程亮分别在大鼠和小鼠饮食中添加果糖,8周后模型动物体重,血清甘油三酯和血糖水平显著升高,肝脏脂肪变性,但未发现NASH的病理表现[7-8]。Charlton M等在高脂饮食基础上添加果糖,构成了由果糖,脂肪与胆固醇组成的饮食,简称为FFC饮食。FFC饮食小鼠具有明显的NASH表型,肝脏内可见肝细胞气球样变和进行性的纤维化[9]。

1.3 胆碱-蛋氨酸缺乏(Choline-Methionine deficiency,MCD)模型 MCD模型是NASH的经典动物模型之一,主要用于NASH及肝纤维化的机制及干预药物研究。此类模型是根据氨基酸和胆碱的缺乏引起线粒体β-氧化功能不能正常工作和极低密度脂蛋白合成量减少密切相关,MCD加重了炎症发生及促进了肝纤维化的早期发生。与其他饮食相比,MCD饮食可在短时间内诱导小鼠出现大泡性脂肪变性、炎症、纤维化病变,并且病变程度更高,较好的模拟人类NASH的疾病表型。欧强等[10]利用MCD饮食分别诱导SD大鼠与C57BL/6J小鼠,8周后大小鼠模型组均出现严重肝脂肪变,不同程度肝组织炎症,以及转氨酶的升高,研究发现,小鼠模型肝组织炎症和纤维化程度均比大鼠严重,更适合用于构建NASH模型。

2 药物模型

此类模型利用药物或化合物作用,通过干扰线粒体DNA的复制、转录或抑制β-氧化诱发肝细胞脂肪变性,使肝细胞脂质成分的合成或摄入量增加,或者释放和代谢的产物减少,使脂肪在肝细胞内的积累量增加。药物中毒性脂肪肝模型具有造模操作简便,时间短,发病时间快等优点,但与人类NAFLD发病机制,病理学改变差异较大,主要用于药效学研究。

2.1 四氯化碳(Carbon Tetrachloride,CCl4)诱发模型 CCl4是最早采用的实验性脂肪肝模型诱导剂,常用于肝纤维化模型的构建,其机制可能与CCl4诱导CYP2E1激活及严重脂质过氧化反应造成肝细胞结构和功能破坏有关[11]。Letteron P等[12]报道,大鼠皮下注射CCl4,短时间内即可观察到中央静脉周中重度大泡性肝细胞脂肪变性,伴有炎症及坏死,后继出现纤维化,肝硬化,但并未出现肥胖,胰岛素抵抗等 NAFLD典型特征。文献显示,构建NAFLD模型时CCl4不单独使用,通常与高脂饲料联合诱导动物,以促进高脂饲料诱导的NAFLD进程,发展为NASH与肝硬化[13]。Kubota等利用高脂饲料联合CCl4诱导小鼠12周,转氨酶水平显著升高,表现为肝脂肪变性,炎性细胞浸润,肝纤维化,但与对照比较,体重无明显变化,胆固醇血糖均下降[14]。Liu Q等利用高脂饲料联合CCl4诱导大鼠8周,造模效果相近[15]。

2.2 链脲霉素(Streptozotocin,STZ)诱发模型STZ是2型糖尿病模型诱导剂,可导致胰岛β细胞破坏及功能受损。新生大小鼠腹腔内或皮下小剂量注射STZ,结合HFD诱导可用于NAFLD模型构建[16]。Fujii M等通过新生小鼠腹腔注射STZ,4周龄时HFD诱导构建模型,2周可观察到单纯性脂肪变性,4周肝脏出现炎症与气球样变,4～8周观察到进行性的纤维化发生[16]。

2.3 二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)诱发模型 DEN具有较强的肝毒性,导致肝细胞DNA损伤突变从而诱发肝癌,与人类肝癌发病过程相近,常用作大小鼠肝细胞癌模型构建的诱导剂。结合饮食诱导,此模型可用于NAFLD中肝细胞癌发生发展的研究。Thompson等[17]通过一次性给21～25日龄小鼠腹腔内注射DEN,喂养HFD 42周,出现NASH表型并伴有肝细胞癌发生。Toriguchi等[18]通过一次性注射DEN结合MCD,16周后也观察到肝细胞癌发生。

3 基因模型

2型糖尿病、动脉粥样硬化或肝癌研究的某些特殊品系大小鼠也可用于NAFLD模型构建。这些特殊品系大小鼠可自发形成脂肪肝,病理呈现显著肝脏脂肪聚集,结合饮食或某些药物诱导,会出现更全面的NAFLD表型,更接近人类NAFLD疾病谱特征。但由于这些特殊品系大小鼠的突变基因在人类极少出现,造模价格昂贵,动物死亡率较高,因此多用于特定病理机制的研究。

3.1 2 型糖尿病类模型 瘦素缺乏型ob/ob小鼠存在瘦素编码基因的自发突变,导致瘦素水平下降,ob/ob小鼠具有严重糖尿病,常用于构建2型糖尿病模型。ob/ob小鼠具有过度肥胖、高胰岛素血症、高血脂症、肝脏脂肪变性等特征,但缺乏小叶炎症,纤维化,不可自发形成 NASH[19-20]。构建NAFLD模型时,ob/ob小鼠常饲喂特殊饮食,如高脂饮食,MCD或被某些化合物诱导如CCl4,可促进NASH的形成。Trak-Samayra等利用高能量饮食诱导ob/ob小鼠,4周后小鼠体重,胆固醇水平升高,12周甘油三酯和转氨酶显著升高,20周肝脏出现大泡样病变并伴有炎症发生[19-20]。瘦素抵抗型db/db小鼠或遗传性肥胖Zuker fa/fa大鼠存在瘦素受体编码基因突变,瘦素受体功能受损,导致瘦素抵抗,具有ob/ob小鼠相似表型,也常结合特殊饮食或药物用于NAFLD模型构建。但由于人类瘦素缺乏很少见,并且瘦素水平与患者NAFLD的严重程度无明显相关性,限制了此类模型的应用范围。

3.2 动脉粥样硬化类模型 载脂蛋白E缺乏型(ApoE-/-)小鼠与低密度脂蛋白受体缺乏型(Ldlr-/-)小鼠更易发生高胆固醇血症,动脉粥样硬化和肥胖。研究表明,ApoE-/-小鼠与Ldlr-/-小鼠结合特殊饲料构建的NAFLD模型疾病严重程度更大。Sinha Hikim等[21]敲除C57BL/6小鼠ApoE基因,在喂食HFD后,发现肝脏脂肪变性更为明显,可表现为NASH,同时出现细胞凋亡,组织学可见肝细胞出现大泡性和小泡性脂肪变性。此类模型可用于研究NASH的心血管疾病发病率与代谢综合征。

3.3 肝细胞癌类模型 PTEN,ALR,MCER基因突变小鼠常用于在NAFLD发展进程中肝癌的研究。PTEN为肿瘤抑制基因,具有NASH背景的PTEN缺乏型小鼠在74～78周可自发形成肝细胞肝癌[22]。ALR基因敲除小鼠出生后两周就可观察到肝细胞脂肪变性,8周可见炎症浸润,肝细胞坏死,52周可出现肝细胞癌变,发生率约为60%[23]。MCER基因突变小鼠结合高脂饮食诱导,20周可观察到包括大泡样病变,炎症,纤维化在内的全面的NASH表型,52周可进一步发展为肝细胞癌[24]。

4 展望

理想的动物模型应能够完全涵盖人类NAFLD整个疾病谱,较好的模拟NAFLD发生发展的过程,具有复制率高,稳定性好,造模方法简便,价格低廉等特点。饮食模型,如高脂饲料诱导的脂肪肝模型,具有操作方法简便,价格低廉,重复性好,死亡率低,较好的模拟了西方人高脂高胆固醇高糖的饮食习惯等优点,成为国内外应用最多的造模方法,但此模型造模时间过长并缺乏肝纤维化等NASH表型。MCD饮食虽能诱导炎症和进行性的纤维化发生,但此模型饲料价格昂贵并且与人类的膳食结构不同,代谢特征与人类NAFLD相反。果糖的添加较好的弥补了以上饮食模型的缺点,相比其他饮食模型,果糖结合高脂肪高胆固醇的FFC饮食较好的复制了人类NAFLD,是目前相对理想的造模方法。药物模型与人类NAFLD发病机制,病理学改变差异较大,常需结合高脂饮食构建复合型模型,如高脂饮食联合CCl4模型等,最大限度模拟了人类 NAFLD的复杂性,病理变化显著,在非酒精性脂肪肝研究中占有很大优势,主要用于NAFLD的纤维化,硬化和肝细胞癌的研究。基因缺乏型动物主要用于构建其他建模方法难以形成的表型,如肝细胞癌等,基因模型构建常需药物或特殊饮食联合诱导。除以上论述的模型外,肠道菌群紊乱与免疫缺陷构建模型的方法也有报道与应用。目前,虽然完全模拟NAFLD表型的完美疾病模型仍未构建成功,但研究者们利用不同造模方法建立的NAFLD大、小鼠模型,具有不同的发病机制和病理改变,为NAFLD发病机制及防治的研究提供了丰富的平台。综合分析以上构建的NAFLD模型特点,未来NAFLD模型的研究将以饮食模型为主,致力于寻找更多的高能量物质配伍诱导动物,优化饮食内物质的配比,以缩短造模时间并完善大、小鼠肝纤维化等NASH表型。同时,在饮食模型的基础上结合多种诱导方法,如结合药物或饮食诱导的肠道菌群紊乱模型,免疫缺陷模型构建复合模型,进一步减少造模时间,提高复制率和模型的模拟程度。