石蜡包埋组织在分子生物学实验中的研究进展

严晓丽 杜梦楠 郑纪宁

(承德医学院，河北 承德 067000)

甲醛固定石蜡包埋是临床病理组织最常规的储存方式，临床石蜡标本包含有丰富的临床信息和病理资料，是进行人类疾病研究非常宝贵的资源。但是由于组织在甲醛固定和石蜡包埋加工过程中引起RNA和蛋白交联及共价修饰等作用，以至提取的RNA质量较差，使得石蜡组织并未在实验研究中得到广泛的应用。而microRNAs(miRNAs)是一种分子链较短且具有调控作用的小分子RNA，可抵抗组织固定和包埋过程对分子结构造成的影响，在加工处理过程中其分子结构和化学性质仍可保持稳定，且目前已经证实miRNAs在多种疾病包括肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用。因此通过对石蜡组织中miRNAs表达的分析研究，可充分发挥石蜡包埋组织在分子生物学实验研究中的作用，尤其对人类疾病的回顾性研究和一些罕见疾病研究做出更多贡献。

1 石蜡包埋组织的价值

基因表达谱可为临床诊断、预后判断、指导临床靶向用药及人类肿瘤的分类尤其是起源不明的转移性肿瘤分类等多个方面提供预测信息〔1，2〕，其中完整RNA的提取是检测基因表达谱的前提。新鲜冰冻组织是提取完整RNA最可靠的来源，但是由于新鲜组织的获取和保存都比较困难，因此限制了一些实验技术在实验研究中更广泛的应用及普及。而甲醛固定石蜡包埋(FFPE)是现阶段临床病理组织最常用的储存形式，组织病理学归档的石蜡组织具有完备的病理资料和临床信息，且在实验研究中容易获得，对人类疾病的回顾性研究和新的分子生物标志物的发现非常有价值。

2 石蜡包埋组织在实验研究的局限性

随着高含量、高通量分子生物技术如定量逆转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)、分子克隆和芯片技术等的出现，归档的FFPE组织中所包含的生物数据信息越来越受到研究者的关注，这些病理标本对于基础和临床方面研究的作用和价值也已得到确认，但并未在分子基因表达研究中得到广泛应用。因为甲醛固定虽有助于组织分子结构和细胞蛋白的保存，但因组织在甲醛固定、石蜡包埋过程中会发生甲醛诱导的核酸与蛋白质交联、共价修饰核酸碱基作用，且在固定前和固定过程中可出现酶解和化学降解等现象及推迟固定和延长固定时间等因素，都会影响核酸的萃取效率及质量与稳定性，从而限制了石蜡组织标本在分子生物实验中的应用〔3～5〕。因此，从FFPE组织中提取完整的、高纯度的RNA极具挑战性〔6，7〕。

近年来，许多研究小组试图突破石蜡组织在分子生物实验研究应用中的局限〔8～10〕。Moelans等〔11,12〕采用多种分子病理实验技术(逆转录定量PCR、免疫蛋白印迹、微卫星不稳定、荧光原位杂交等)测试对比3种新型且毒性更低的固定液(含酒精的非交联固定液FineFIX、RCL2与交联固定液F-Solv)和传统的中性甲醛(NBF)固定液的总体固定效果，发现从RNA的萃取效率、纯度及完整性方面看，新型固定液效果看似更好。但从组织形态学、蛋白质提取及免疫组织化学等效果综合评估看，这3种新型固定液的固定效果次于NBF。比较还发现由F-Solv与FineFIX固定的组织硬度较大，由RCL2固定的组织较软而滑，这些均不利于组织切片，对常规病理诊断带来不便。此外，综合考虑特殊组织如淋巴结的固定、组织固定过程中引起不同程度的收缩、色素沉着及细胞脱颗粒与溶解等因素，最终得出这3种新型固定液对组织的固定效果均次于甲醛，因此，尚不能替代NBF用于临床活检组织与手术标本的固定。

另外，多项研究表明从FFPE 组织中提取的总RNA 片段长度不超过300 bp〔12,13〕。Doleshal等〔14〕通过比较从不同器官石蜡组织和相应的冰冻组织中提取的RNA质量发现，新鲜冰冻组织中提取的RNA质量较好，有明显且清楚的18S和28S rRNA条带，而从石蜡组织中提取的RNA平均分子量低于100个核苷酸，组织标本在加工过程中的处理条件如时间、温度及石蜡组织存放的年限都会对RNA的完整性产生明显影响。Cronin等〔13〕从保存不同年限的乳腺癌石蜡包埋组织中提取RNA并分析了其片段大小，发现保存1年的石蜡组织较保存1～17年的石蜡组织中RNA有更大的平均分子量。以上均说明从石蜡组织中提取的RNA质量较差，因而使石蜡组织未能在分子生物实验研究中得到广泛应用。近年研究发现，如原位杂交、Northern杂交等可用于FFPE组织中基因表达的检测研究〔15～18〕，但这些方法并不适合高含量、高通量分子的分析，因此在实验研究中尚不能代替qRT-PCR方法。因此，目前既未有更新的分子检测技术被开发，也没有能提高石蜡组织中核酸质量和完整性恢复的新固定方法被发现，这些技术工艺的不足限制了石蜡包埋组织在疾病分子研究及基因表达分析研究中的应用。随着基因组研究的不断深入，近年有关miRNAs的研究越来越受到研究者的关注，新的miRNAs不断被发现，但其具体的作用机制及其上下游的调控基因都还不清楚。

3 miRNA的介绍及在石蜡包埋组织中的研究

miRNAs是一种长度18～25个核苷酸的非编码小分子RNA，具有在转录后水平调控基因表达的功能。与mRNA不同，mRNA必须翻译成蛋白质才能发挥一定的生物作用，而miRNAs的表达水平与其基因的功能有更密切关系。且miRNAs的化学性质相较于mRNA更稳定〔19,20〕。miRNAs具有多种特性，通过对石蜡包埋组织中miRNAs表达的研究，这些牧场生使得石蜡组织标本成为研究基因表达谱的可靠资源。miRNAs特性之一是miRNAs位于基因序列的上游调节区。成熟的miRNA可与诱导沉默复合物(RISC)结合形成RISC复合体，RISC复合体特异性识别靶mRNA的3′-非编码区(UTR)，通过与靶mRNA的3′-UTR碱基互补配对实现降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻译，进而调控靶基因的表达〔21〕。已有大量研究报道miRNAs在细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤形成及化疗耐药等多个生物过程中发挥重要作用〔22,23〕。另外，基因组研究表明，单个的miRNA可以调节数百个靶mRNA〔24〕。因此，miRNA很可能成为临床上诊断疾病、判断预后的生物标志物及治疗靶点。第二，miRNAs的分子结构和化学性质在石蜡组织中仍保存良好。因为miRNAs分子链很短，其分子结构几乎不受甲醛固定、石蜡包埋操作过程的影响，从而可对抗组织在加工处理过程中引起的RNA分子链断裂、RNA与蛋白质交联及化学修饰等影响。目前已有多项研究〔25,26〕表明，miRNAs在石蜡包埋组织中性质稳定，通过qRT-PCR方法比较mRNA与miRNAs在石蜡包埋组织和新鲜冰冻组织中表达水平的差异发现，mRNA由于分子链长、蛋白酶降解与化学修饰等原因使其表达水平在两类组织中的相关性较弱，而通过对石蜡包埋组织和新鲜冰冻组织中miRNAs的表达水平进行分析发现，这两类组织中miRNAs的表达水平有明显相关性，且miRNAs表达水平的多少与甲醛固定时间及石蜡组织储存时间无密切关系，说明miRNAs的化学性质在石蜡组织中较mRNA保持更稳定。第三，miRNAs作为分子标志物可通过多种分子生物学实验方法被检测出。miRNAs在组织细胞内的含量较低，这对于其检测是一个挑战。而qRT-PCR技术有特异性强、灵敏度高等优点，可对组织细胞内表达量较低的目的基因进行检测。另外，已有多项研究〔27,28〕已通过芯片技术对石蜡组织中的miRNAs表达水平进行分析，所得结论与qRT-PCR结果相一致，进一步说明miRNAs在石蜡组织中保持有较好的稳定性。第四，miRNAs还可能受RISC复合物的保护而免受可引起RNA降解的因素带来的影响〔29〕。因此，病理资料齐全、临床信息完善的石蜡包埋组织作为一个现成的资源，在进行miRNAs表达分析的研究中是非常宝贵和理想的实验材料。

由此猜想，细胞株在经过甲醛固定石蜡包埋处理后其石蜡细胞块中miRNAs的稳定性是否仍可保持良好，如果可以，那体液如胸、腹水等含有的细胞也可做成石蜡细胞块储存并进行下一步的实验与研究，这将为临床病理的分子生物实验提供一种新的实验材料和资源。Li等〔29〕以快速冰冻的细胞与甲醛固定石蜡包埋细胞块为材料对比分析两类细胞中miRNAs表达水平的变化，结果显示在两类细胞中提取总RNA量相同的情况下，石蜡包埋细胞块的总RNA中包含的miRNAs量更多，大约是新鲜冰冻组织中所包含的2倍，原因可能是产生等量的总RNA所需的石蜡包埋细胞数较新鲜冰冻细胞数更多，这很可能也是由于在固定和包埋过程中引起细胞块的RNA和蛋白间的甲基化交联与共价修饰等因素导致提取的总RNA量减少，而miRNAs几乎不受这些作用的影响。多项实验研究证明miRNAs的表达水平在保存10年的石蜡组织中还保持相对稳定〔26,30〕。总之，石蜡组织中miRNAs的分子结构和化学性质比较稳定，其表达水平与新鲜冰冻组织相比较几乎没有明显变化，有望成为分子病理检测的一个新靶点。另外，还有研究发现miRNAs参与了各器官的发展，在不同组织中miRNAs的表达存在差异，表现出明显的组织特异性〔31～33〕，因此miRNAs还有助于判断起源不明的转移性肿瘤的组织来源。

综上，mRNA在甲醛固定石蜡包埋过程中可能会发生交联反应和共价修饰，从而导致石蜡组织中总RNA的萃取效率和质量下降，因而限制了具有丰富病理资料和临床信息的石蜡组织标本在分子生物学实验研究中的应用。但miRNAs由于分子量短，其分子结构和化学性质几乎不受固定与包埋过程的影响，因此在临床归档的石蜡包埋组织中，miRNAs表达相对于mRNA更稳定和准确。miRNAs在细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤形成的多个过程中发挥重要作用，但目前miRNAs在这些生物过程中详细的分子调控机制及其上下游的调控基因尚未完全阐明，因此，随着对miRNAs研究的不断深入及实验技术的不断成熟，通过对石蜡包埋组织中miRNAs表达量的分析，miRNAs有可能成为一种新的临床诊断、预后判断、反映治疗效果、指导临床用药的新的分子生物标志物。同时，石蜡组织标本在基础、临床及人类疾病回顾性研究和一些罕见疾病的分析等方面也将会有更广阔的应用前景。