Notch信号通路调控Treg/Th17细胞机制的研究进展

张珊，刘宝山

Notch信号通路是一条高度保守的信号通路，在细胞间的信息交流中扮演重要角色。Notch信号广泛存在于多种细胞中，如造血细胞［1］、巨噬细胞［2］等。在免疫系统中，Notch信号通路不仅可以调控T/B细胞谱系的产生，还参与调节外周成熟T细胞及其亚群分化及功能的发挥，如Notch信号可在CD4+T细胞表面广泛表达，对调节性T细胞（Treg）、辅助性T细胞17（Th17）的增殖、分化、凋亡及细胞发挥免疫功能产生重要影响［3］。最近研究表明Notch信号通路与多种免疫功能异常的疾病有着密切的联系，如再生障碍性贫血、类风湿性关节炎［4］、自身免疫性脑脊髓炎等。本文简要综述了Notch通路对Treg/Th17的调控机制及两者在血液系统疾病、自身免疫系统疾病中的联系。

1 Notch信号通路的组成与活化

Notch信号通路根据是否依赖RBP-Jκ可分为经典通路和非经典通路，其主要由Notch受体、配体、CSL DNA 结合蛋白（CBF1、Suppressor of Hairless、Lag1的合称）、调节分子及其他效应物组成。目前发现哺乳动物中共有4种受体（Notch1-4）、5种配体（又称为DSL结构域）。Notch配体分属于2个家族：Dll家族（Dll1、Dll3、Dll4）和 Jagged家族（Jagged1、Jagged2）。由于Notch1-4的胞外端EGF区和胞内段的PEST区域存在较大差异，4种受体功能存在一定的差异，靶基因也有所不同。Notch1主要存在于胸腺细胞、巨噬细胞以及骨髓的前体细胞中；Notch2存在于胸腺细胞、B淋巴细胞以及前体细胞中；Notch3在许多不同种类的造血细胞中均有表达；Notch4主要存在于内皮细胞。对于Notch配体来讲，Jagged家族、Dll家族在骨髓与胸腺中均有表达，对中枢免疫系统的淋巴细胞分化起着不同作用。Dll1、Dll4主要诱导造血干细胞、胸腺淋巴细胞向T细胞系列发育，但Dll1主要促进前体T细胞发育；Jagged1、2也可促进T细胞发育，但有向自然杀伤（natural killer，NK）细胞发育的潜质。

Notch受体以单体蛋白的形式合成，在S1位点被furin样蛋白酶裂解，形成的2个亚单位以共价键连接，结合形成异二聚体。在受体转移至细胞膜前，Fringe蛋白将EGF样重复序列糖基化。当Notch受体胞外部分转移至细胞膜与配体结合时启动Notch信号途径，随后发生2次水解过程，释放出具有核定位信号的胞质区（Notch intracellular domain，NICD），NICD转移至细胞核内，与CSL（又称为RBPJ或CBF1）结合并招募核转录激活蛋白MAML等，形成三元络合转录激活物，激活下游靶基因如Hes、Hey、Deltex1、IL2RA等，进而调节细胞发育各个过程［5］。Notch蛋白还可以通过非依赖RBP-Jκ方式激活Notch通路，具体机制还不十分清楚［6］。此外，Notch信号通路还可与其他信号通路之间存在“对话”、“协同表达”，如核因子-κB（NF-κB）、缺氧诱导因子（HIF）、转化生长因子（TGF）-β等。

2 Th17细胞及Treg细胞的生物学特性及功能

幼稚CD4+T细胞需要经过刺激从而分化成与细胞免疫密切相关的Th1、Th2、Th17、Treg等细胞亚群。其分化进程受到细胞外分子（如细胞因子）和细胞内分子（如转录因子）的调节。

Th17细胞因主要分泌白细胞介素17（IL-17）而得名，在自身免疫性疾病中发挥主要作用，其主要功能为招募中性粒细胞等炎性细胞，引起细胞浸润、组织破坏。另外，Th17还可分泌IL-21、IL-22、IL-26等多种细胞因子。Th17细胞核内表达视黄酸相关孤 儿 受 体 γt（retinoid acid-related prphan receptor gamma t，RORγt）和信号传导及转录激活因子 3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3），两者对Th17细胞的发育和相关细胞因子的产生极其重要［7］。Th17细胞的分化还受多种细胞因子的调节，IL-6、TGF-β、IL-21、IL-23等在Th17细胞分化过程中起积极的促进作用，而IL-27、IL-2、干扰素（IFN）-γ等则参与Th17细胞分化发育的负向调控［8］。

Treg细胞由Gershon等发现，在维持体内免疫稳态过程中起关键作用［9］。初始T细胞可在TGF-β作用下生成Treg，而Treg细胞主要分泌IL-10、IL-35、TGF-β等细胞因子。叉状头/翅膀状螺旋转录因子（Fork/winged helix transcription factor，Foxp3）作为免疫调节的关键因子，是Treg细胞的特异性转录因子，影响Treg细胞的分化及功能。Treg细胞功能失调及Foxp3表达异常均可导致机体的多器官自身免疫反应及早期死亡［10］。

3 Notch信号通路对Treg/Th17细胞的调控

间充质干细胞（MSCs）介导的免疫调节参与Treg 细胞的增殖，而此过程依赖 Jagged1［11］。Yao等［12］在体外培育Treg细胞时，发现蜕膜血管内皮细胞（decidua vascular endothelial cell，DVEC）表面表达Notch配体如Jagged1、Dll1、Dll4，可维持Foxp3的表达，进而促进Treg细胞的增殖和分化，同时在Treg细胞表面可检测到高表达的Notch1受体，使用慢病毒shRNA转导下调Treg表面Notch1受体可使Foxp3表达下降，而Foxp3是Notch信号通路下游的靶基因。另外，Notch信号通路和TGF-β信号通路之间存在对话，TGF-β通路活化后可上调Hes1的表达［13］，Notch也可与 TGF-β通路内的细胞传感器Smad3协同合作，或者NICD与Smad3直接作用，在CSL和NICD存在的情况下，Smad3被招募到CSL结合位点，从而对调控Treg的分化产生影响。

Keerthivasan 等［14］研 究 表 明 Notch1 可 通 过RORγt和IL-17基因启动子调控Th17细胞的表达。Wang等［15］则认为Jagged1通过降低RORγt的表达，进而抑制Th17细胞的分化。也有研究认为RBPJ是IL23R关键驱动者，IL-23R信号也参与Th17细胞的调控，RBPJ通过绑定和反式激活IL23R启动子诱导IL-23R表达［16］。另外，树突细胞（dendritic cell，DC）表达的Notch信号可作为Treg/Th17平衡的调节器。有研究发现RBPJ缺陷小鼠的DC促进了Th17细胞的分化，而抑制Treg细胞的分化；这与其可表达少量的Aldh1a2蛋白有关，该蛋白能促进维甲酸的合成；但RBPJ缺陷小鼠的DC过表达Aldh1a2蛋白，却不能促进Th17细胞的分化［17］。

3.1 Notch通路调控Treg/Th17与造血系统疾病的关系 再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）是一种自身免疫性疾病，Li等［18］研究发现Notch/RBP-J/Foxp3/RORγt途径可以调控Th17/Treg细胞的平衡，AA患者输注MSCs后外周血中Th17比例下降、Treg比例增加，而且Dll1、Jagged1、Notch1-2也有所增加；该团队进一步检测了AA患者Notch相关转录因子的表达情况，发现RBP-J、Foxp3增多，而RORγt降低；与转录因子表达相一致，细胞因子TGF-β升高，而TNF-α降低。这表明MSCs调节Treg/Th17平衡依赖Notch信号途径，RBP-J作为Notch信号通路的效应蛋白，与Foxp3、RORγt之间存在密切联系。Th17/Treg平衡失调在免疫相关性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）中也扮演着重要角色，Yu等［19］研究发现应用γ分泌酶抑制剂DAPT对ITP患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）进行处理后，RORγt、IL-17 及 Notch1、Hes1、Hey1表达减少，而Treg及Foxp3没有显著变化，Notch信号表达参与了ITP患者Th17细胞的调节，DAPT抑制Th17细胞分化与RORγt、IL-17转录下调有关，因此，Notch信号失活可能成为ITP患者潜在的免疫调节策略。然而黄文烨等［20］认为ITP患者体内Treg数量降低，表达和分泌TGF-β较少，诱导靶细胞表面Notch1表达上调及激活Notch1-Hes功能减弱，对靶细胞免疫抑制作用减弱，从而引起自身反应性T细胞过度活化。在T淋巴细胞白血病中，Luo等［21］证明了Notch信号与Foxp3之间存在“crosstalk”，Notch1信号通路可能通过p-ERK1/2、STAT1、NF-κB等靶基因参与Treg细胞的分化。

3.2 Notch调控Treg/Th17与自身免疫系统疾病的关系 Li等［22］研究发现过敏性哮喘患者较正常对照组Notch1 mRNA水平显著增高，Th17/Treg细胞比例上调。这表明Th17/Treg平衡失调在过敏性哮喘中可能因Notch1过表达引起的，Notch1与Th17发育分化密切相关。另一项研究则发现给予DAPT的哮喘小鼠组较模型组IL-17水平降低，而IL-10、TGF-β水平升高［23］。Zhang等［24］认为IL-17水平下调与阻断Notch信号后NICD表达降低有关。Huang等［25］进一步探索发现，Dll4同时可诱导Treg及Th17细胞的分化，但对Foxp3的调控存在优势；阻断Dll4后过敏性哮喘反应加重，而阻断Jagged1作用则相反。

Notch信号的表达可能促进自身免疫性脑脊髓炎 （experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）、类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）等疾病的发生及进展。Wongchana等［26］发现巨噬细胞表面Notch1基因敲除的EAE小鼠IL-6和CD80表达降低，而且分泌的IL-17也减少，认为Notch1/CSL/RBP-Jκ通路可能通过调节IL-6及共刺激分子CD80的表达从而参与Th17的促炎反应。Bassil等［27］研究则发现在EAE小鼠模型中，Dll4可抑制TGF-β以及Foxp3表达过程中的酪氨酸蛋白激酶JAK3以及STAT5磷酸化，而STAT5是Foxp3表达必不可少的转录因子。而对于RA来讲，Th17是其发病的重要免疫细胞，Treg细胞则有利于RA的缓解。有研究表明，RA小鼠经DAPT处理后，Th17细胞及IL-17减少，并显著地降低了关节炎症状和关节损伤的严重程度［28］。而且Notch3与Th17增殖与分化密切相关，应用Notch3单克隆抗体可减少Th17细胞及相关因子的表达，但对Treg细胞无明显抑制作用［29］。

3.3 Notch调控Treg/Th17与其他疾病的关系 Qin等［30］研究发现慢性丙肝患者较正常对照组PBMC中Notch1、Notch2 mRNA显著增多，应用DAPT后，Th17相关因子RORγt、IL-17、IL-22等水平下降，而Treg相关因子Foxp3、IL-10水平没有显著变化，但Treg细胞的抑制功能降低。这表明Notch信号通路调控Treg与Th17细胞数量的同时，还可以对两者的功能产生影响。Treg细胞在母体预防胎儿免疫排斥中起重要作用，敲除DEVC表面Jagged1和Dll1配体，Treg细 胞 表 达 受 到 抑 制［12］。 Cao 等［31］研 究 发 现 因Notch1-4受体及Dll4水平显著升高，妊高症患者外周血Th17相关因子增多，Treg相关因子减少。以上诸多研究证明，Notch信号通过调控Treg/Th17广泛参与免疫系统疾病的发生、发展，Notch信号通路的激活可能是调节两者关系的关键，进而可激活其他通路共同参与Treg/Th17的调控。因此通过调控Notch信号通路中的各个相关靶点，促进两者调控的平衡，有利于免疫系统失衡疾病的恢复。

4 Notch信号调节的复杂性

由于不同疾病产生的内在环境不同，Notch信号受体与配体结合激活下游靶基因类型不同，由此可激活其他信号通路，因而同一种受体或配体对Th17和Treg细胞的调控不同。Contaz等［32］发现，Notch信号作用的发挥具有环境依赖性。当Notch负调控Th17细胞的分化时，Notch能够通过影响胞内细胞因子的转运而促进Th17细胞因子的释放，从而抵消原有的效应。也有研究认为，Notch既不单一启动T细胞程序，也不受细胞因子的影响，而是同时调控Th细胞的基因序列［33］。即使在强极性的情况下，Notch也可直接调节CD4+T细胞的分化。而且，Th17和Treg细胞在分化上高度相关，两者具有高度的可塑性。这更增加了探究Notch通路调控Th17、Treg细胞平衡机制的难度。

5 总结与展望

综上所述，Notch信号途径在CD4+T细胞及其亚群的增殖、分化及功能的调节中具有重要意义，目前对Notch信号的研究尚处于起步阶段，Notch信号通路介导调节Th17/Treg细胞机制及对机体各种疾病的影响尚未完全清楚，进一步探明Notch信号途径及对CD4+T细胞的调节过程，不仅有助于免疫学理论的发展，还在血液系统疾病、自身免疫性疾病中均有潜在的应用价值。

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