Galectin-9/Tim-3信号通路在HBV感染中对机体固有免疫及适应性免疫调控的研究进展①

刘亚男 余 追 姚 兰 柳 舟 侯 果

(武汉大学人民医院重症医学科,武汉430060)

近年来，乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染后机体免疫调控机制的研究越来越受到重视。在HBV感染过程中，特异性T细胞功能的耗竭，与HBV感染的慢性化密切相关。耗竭的T细胞增殖能力、分泌效应细胞因子的能力以及毒性杀伤能力降低，不能够起到有效清除病毒的效应，从而导致HBV不能有效清除。因此，对诱导HBV病毒特异性CD8+T细胞功能耗竭因素的研究十分重要。耗竭的T细胞一个重要的特点就是过表达一些抑制性表面分子，包括程序性死亡受体-1(Programmed death 1 receptor,PD-1)、淋巴细胞激活基因-3 (Lymphocyte-activation gene 3,LAG3)以及T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T cell immunoglobulin and mucin domain containing molecule 3,Tim-3)等[1,2]。这些受体分子能够与其相应的配体结合，例如Tim-3与其配体半乳糖苷结合蛋白9(β-galactoside-binding protein,Galectin-9,Gal-9)结合，诱导T细胞功能耗竭。

Tim-3及其配体Gal-9在包括HBV在内的多种病毒感染所致的T细胞功能紊乱过程中发挥着重要作用，是参与诱导T细胞耗竭的重要负调控分子之一。有研究发现，在HBV感染所致肝脏炎症的过程中，主要由库否细胞(Kuffer cell,KC)表达的循环中的Gal-9蛋白增多[3]，这与丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)研究中发现的结果一致[4]。同时此研究还发现，HBV感染者与健康对照相比，HBV特异性CD8+T细胞表达的Tim-3分子明显上调。而体外阻断Gal-9/Tim-3这一通路，能够有效恢复HBV特异性CD8+T细胞的功能，使其分泌效应细胞因子和增殖能力增强[3]。另有研究发现，在对HBV感染相关的肝癌患者中，Gal-9和Tim-3分别在癌组织的KC和T细胞上高表达，参与介导T细胞功能的耗竭[5]。

在病毒感染过程中，大量IFN-β和IFN-γ的产生，诱导Gal-9在肝脏中大量表达。大量表达的Gal-9与病毒特异性CD8+T细胞表面的Tim-3分子结合相互作用，诱导T细胞功能耗竭，细胞凋亡[4,6]。另外，大量的Gal-9表达，促进肝内Tregs细胞增殖，进一步抑制抗原特异性T细胞的功能[4]。另有研究发现，在急性感染期和慢性的乙肝患者的外周血中，CD4+和CD8+T细胞表达Tim-3上调，并且发现抗病毒治疗后的慢乙肝患者以及急性患者的恢复期，Tim-3表达减少[7]。

1 Gal-9与Tim-3分子特点

1.1Gal-9分子特点 凝集素家族是一群糖结合蛋白，这一家族的分子都有1～2个保守的具有较高的半乳糖亲和性的识别碳水化合物的结构域[8]。它们在哺乳动物的组织中分布广泛，到目前为止，已经鉴定出15种属于这个家族的蛋白。在固有免疫和适应性免疫细胞中，Galectins的表达也非常丰富，它们在机体免疫耐受和炎症反应过程中发挥着重要作用[9]。Gal-9作为凝集素家族的重要成员之一，在病毒感染的过程中，发挥着重要作用。一系列的研究表明，它是一个起着关键作用的免疫调控分子，不仅参与调控细胞黏附、迁移、增殖和凋亡，还能够直接与病原微生物相互作用，还可以影响Treg细胞的分化和功能以及树突状细胞(Dendritic cell,DC)的成熟和抗病原微生物效应[10,11]。

Gal-9最早是从霍奇金病患者的肿瘤组织中克隆出来的，最初被认为是嗜酸性粒细胞趋化因子[12]。其分子结构具有Galectins家族的串联-重复的特点，分子两端分布两个相似的糖识别结构域(Carbohydrate reconciliation domain,CRD)，两端的CRD被一个较短的连接肽结合在一起[13]。人的galectin-9分子N和C末端的两个CRD，分别含有148和149个氨基酸，CRD功能结构域是其能够与Tim-3结合的重要结构特征。同时，根据其连接肽的长度不同，共分为3个转录异构体。较长的连接肽包含58个氨基酸，中等长度的饱含26个氨基酸，最短的只包含14个氨基酸[14,15]。3个异构体不同的生物学功能之间的区别未见报道。

与Galectins家族的其他蛋白相似，Gal-9在组织和细胞中表达很普遍，在嗜酸性粒细胞、内皮细胞、T淋巴细胞、DC、巨噬细胞、KC、淋巴结、小肠上皮细胞以及血管内皮细胞中均有表达[4,11,16,17]。Gal-9能够与多种配体如Tim-3、细胞蛋白二硫键异构酶、IgE等结合[15,18,19]。因此Gal-9在调节机体固有免疫和适应性免疫的过程中，能够通过与不同的配体结合在不同的系统中发挥多向调节的作用。研究表明，Gal-9与T细胞表面的Tim-3分子结合，能够诱导细胞Ca2+内流，并通过caspase-1信号通路诱导T细胞凋亡[20-22]。

1.2Tim-3分子结构特点 Tim-3是T细胞免疫球蛋白黏蛋白(Tim)家族中的一员。Tim家族蛋白通常表达在细胞膜表面，可作为可溶性分子或者细胞表达的配体分子的受体；Tim家族的一个共同特点就是其蛋白的胞外段均包含一个位于N末端的免疫球蛋白多变区(IgV)，此区约由100个氨基酸组成且包含一个富有丝氨酸/苏氨酸的黏蛋白区。另外，Tim家族分子胞质内的C末端富含酪氨酸，这个特点与Tim家族分子激活胞内信号通路的功能密切相关[23-26]。

Tim-3是由甲型肝炎病毒细胞受体2(Hepatitis A virus cellular receptor 2,HAVCR2)基因编码的I型跨膜蛋白[27]。HAVCR2基因饱含7个外显子，其中外显子1编码信号肽序列，2编码蛋白的IgV区，3～5主要负责编码黏蛋白结构域，而6和7则编码胞内段。HAVCR2基因的1、2、6和7外显子还能表达能够抑制T细胞免疫反应的可溶性Tim-3蛋白，但是对于Tim-3的研究主要集中于其膜表达形式的蛋白在免疫调节中的重要作用[28-30]。

Tim-3作为膜受体蛋白，主要通过与相应的配体结合发挥作用。Tim-3有多个配体，包括磷脂酰丝氨酸、高迁移率族蛋白B1(High-mobility group box 1,HMGB1)以及Gal-9等[31-33]。Tim-3的IgV区含有糖基化位点的黏蛋白样结构域，使其能够被Gal-9所识别。Zhu等[15]第一次发现了Gal-9是Tim-3的配体之一，并发现Gal-9/Tim-3参与调控T细胞免疫反应。人和小鼠的Tim-3胞内段分别为77和66个氨基酸序列，均含有被高度保守的氨基酸序列所包绕的6个酪氨酸序列，在对野生型小鼠和基因突变小鼠的研究中发现，这几个酪氨酸序列是胞内酪氨酸激酶的潜在识别位点，是Tim-3参与调控细胞信号转导途径的关键位点，但具体的调控过程和对细胞的影响目前并不清楚[23,24,34]。

Tim-3在Th1、Th2、B细胞、T细胞、DC、巨噬细胞(Macrophage,Mφ)等多种免疫细胞上均有表达[30]。近年来，作为抑制性受体之一，关于Tim-3的研究更多地集中在病原体感染后其对效应T细胞功能调节的作用和机制。已有研究表明，阻断Tim-3蛋白的功能，可上调机体CD4+T和CD8+T细胞功能，提示Tim-3在机体免疫调节的网络效应中起着负调控的作用[7]。Gal-9是Tim-3这一膜受体的重要配体之一，大量的研究数据显示，Gal-9/Tim-3通路在HIV、HCV和HBV感染过程中，均参与机体免疫功能的调节，特别是病毒特异性T细胞功能的紊乱，导致病毒清除延迟，诱导感染慢性化[35-37]。

2 HBV感染过程中Gal-9/Tim-3对适应性免疫反应的调节

2.1Gal-9/Tim-3通路与效应T细胞 在慢性病毒感染(如HBV、HCV及HIV等)中，均观察到效应T细胞的功能耗竭。如前所述，耗竭的T细胞过表达负性调控分子，Tim-3是负性调控分子中的一员。在对HIV感染的研究中发现，HIV患者外周血中Tim-3+CD8+T细胞比例升高，且与Tim-3-T细胞相比，其功能也有损伤[38,39]。

在对慢性乙肝患者(Chronic hepatitis B,CHB)研究中发现，CHB患者外周血中T细胞表面Tim-3分子的表达量与疾病进展及严重程度密切相关，Tim-3的表达随着肝脏炎症损伤加重而升高，病情好转而降低[40]。通过对高压尾静脉注射HBV质粒建造的小鼠HBV复制模型的研究发现，肝内过表达Tim-3的CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力显著降低，而沉默Tim-3，则能够增强IFN-γ分泌并能够间接促进HBV中和抗体的产生[41]。与CHB不同，在急性乙肝患者(Acute hepatitis B，AHB)中，感染的早期能够观察到效应T细胞Tim-3表达增多，但肝脏的炎症程度和血清中IFN-γ水平没有关系，并且在疾病的恢复期Tim-3的表达迅速降低[7]。上述发现表明，在HBV感染过程中，Tim-3通路在诱导效应T细胞耗竭的过程中，发挥着重要作用。

如前文所述，病毒感染后肝内分泌的IFN-γ及IFN-β诱导Gal-9大量表达，表达的Gal-9与T细胞表面受体Tim-3结合削减CD8+T细胞分泌细胞因子和增殖能力。而在对慢性HBV感染中发现，Gal-9/Tim-3通路上调与诱导T细胞功能耗竭相关。另有研究发现，体外阻断Gal-9/Tim-3通路能够重建HBV特异性CD8+T细胞的功能，有效恢复其毒性杀伤功能、分泌IFN-γ的能力及增殖功能[3,4,6]。近期有研究者对HBV感染所致的肝细胞性肝癌的研究中发现，在肝癌组织与癌旁组织中Gal-9、Tim-3表达上调，并有T细胞功能紊乱密切相关[5]。

2.2Gal-9/Tim-3通路与Treg/Th17 细胞 Treg细胞是一类CD25+Foxp3+CD4+的调节性T细胞，这类细胞能够分泌抑制性的细胞因子如IL-10、TGF-β等，从而抑制T细胞功能[42]；而Th17是近年来发现的CD4+T细胞的一个亚群，以能够分泌细胞因子IL-17为主要特点[43]。近年来，大量研究发现，Treg与Th17两种细胞类型在包括HBV在内的慢性病毒感染过程中起到负性调控T细胞功能的作用。在对CHB患者的外周血及肝组织检测中发现，患者单核细胞中这两类细胞的比例明显增高；增高的Th17的比例，与肝脏损伤的炎症程度密切相关[44-46]。

Gal-9/Tim-3通路参与调控多种免疫细胞的功能，包括Treg。研究表明，体外阻断Gal-9/Tim-3通路，能够有效降低Treg的抑制功能[47,48]。在小鼠体内，Treg细胞自然表达Tim-3;而人类Treg细胞静息状态下并不表达Tim-3，但激活后则上调Tim-3表达。同时，Tim-3阳性的Treg细胞，还表达LAG3、T淋巴细胞抗原4(T-lymphocyte antigen 4,CTLA-4)、TNF受体及PD-1等负性调控分子[47]。另外，在对肿瘤的研究中，Tim-3已经被认定为是Treg细胞的一个分子标志[49]。

Tim-3被报道参与调控Th17细胞的功能，在这个过程中，Tim-3能够抑制Th17细胞激活及分泌IL-17的能力[50]。然而，针对慢性病毒感染如HCV、HBV等，Tim-3在Th17细胞上的表达特点的研究并不多。总之，在慢性HBV感染过程中，Gal-9/Tim-3通路在调控机体适应性免疫中发挥着十分重要的作用，其表达上调，抑制机体抗病毒反应，参与诱导病毒感染持续。而阻断这一信号通路，能够有效恢复机体效应T细胞功能，对CHB患者的病毒控制有着非常重要的意义。因此，Gal-9/Tim-3这一信号通路可能在未来会成为CHB治疗的一个新的作用靶点。

3 HBV感染过程中Gal-9/Tim-3对固有免疫反应的调节

适应性免疫在HBV感染中的作用非常重要，而固有免疫对HBV相关的疾病进展也至关重要。在HBV感染过程中，固有免疫系统的病原相关分子模式及其信号通路激活的相关固有免疫反应，发挥着非常重要的作用。与T细胞不同，许多重要的固有免疫细胞如NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞以及单核细胞等，通常均表达Tim-3分子，而在病理状态下，这些固有免疫相关的细胞类型Tim-3表达上调，干扰Gal-9/Tim-3通路则改变这些固有免疫细胞的功能[51,52]。

3.1Gla-9/Tim-3通路与单核细胞及巨噬细胞 单核细胞与巨噬细胞是固有免疫系统中两个非常重要的细胞类型。机体遭遇病毒入侵后分泌大量的炎症因子，诱导单核细胞迅速聚集于感染病灶并大量增殖分化为巨噬细胞，杀伤病原体。在CHB患者疾病后期发展为慢加急性肝衰竭的患者中，单核细胞表达Tim-3明显上调，并且与患者的ALT水平呈正相关，提示单核细胞Tim-3表达水平与疾病进展密切相关[53]。

在HBV感染过程中，巨噬细胞在病毒的清除和肝脏炎症损伤过程中都发挥着重要的作用。巨噬细胞包括两个亚型M1和M2，在HBV感染中，M1亚型主要参与病毒的清除，而M2亚型则减缓宿主的固有免疫反应，致使HBV感染慢性化，促进HCC的发生发展[54,55]。有研究报道，病原感染诱导巨噬细胞表达Tim-3上调，可能参与调控这类细胞的激活以及细胞因子分泌[56]；Toll受体的配体之一脂多糖能够抑制巨噬细胞Tim-3的表达，并有效恢复巨噬细胞部分杀伤功能，提示TLRs及其下游信号通路参与调控Tim-3的表达[57]。值得注意的是，Gal-9/Tim-3通路对固有免疫的调控作用较适应性免疫复杂，在有关HCC的一篇报道中指出，Tim-3能够诱导巨噬细胞由M1型转化为M2型，从而抑制HCC患者的肝脏炎症反应[52]。

3.2Gla-9/Tim-3通路与DC 在CHB疾病进展过程中，DC作为重要的抗原提呈细胞之一，发挥着重要的免疫作用。在体内，DC细胞调控着HBV病毒的识别。研究报道，与健康对照者相比，HBV感染者DC细胞的功能受到损伤，但是损伤的机制尚并不明确[58,59]。DC细胞表面也表达Tim-3，并且与DC的激活相关。激活Gal-9/Tim-3通路能够使DC合成和分泌细胞因子TNF-α。另外，在荷瘤裸鼠肿瘤动物模型中的研究发现，激活Gal-9/Tim-3信号通路，能够使成熟的DC数量增多，并使其抗肿瘤能力增强[60]。然而，另有研究认为Gal-9/Tim-3通路上调可能负调控DC的功能。例如，一项研究发现，Tim-3阴性的髓系来源的DC细胞(Bone marrow-derived DCs,BMDCs)与Tim-3阳性的BMDCs细胞相比，后者的功能显示受到损伤，分泌细胞因子IFN-β1、IFN-α和 IL-6的能力明显下降。

目前关于Tim-3调控DC细胞功能在HBV感染中的研究尚未见报道，但是在一项HCV的相关研究中发现，HCV感染患者DC的功能受到损伤，而持续阻断Tim-3则能够在一定程度上恢复受损的DC的功能，这间接提示Tim-3可能起到抑制DC功能的作用[61]。

总之，Gal-9/Tim-3通路对DC起到的调控作用目前并不明确，而在HBV感染中这一通路对DC的调节，尚未见相关报道，有待进一步探索。

3.3Gla-9/Tim-3通路与NK细胞及NKT细胞 在肝脏中，NK细胞的数量几乎是脾脏或者血液中的5倍，它是肝脏中比例最大的固有免疫细胞，在肝内的固有免疫反应中发挥着极其重要的作用。NK细胞在HBV感染中也发挥着重要作用，研究发现CHB患者外周血中NK细胞的数量显著低于健康人群[62，63]。

关于Gal-9/Tim-3通路在调控NK细胞的功能的研究，目前有两种观点。一种观点认为Tim-3是NK细胞成熟的一个标志，相关支持性的研究发现，Gal/Tim-3通路激活能够增强NK细胞分泌细胞因子IFN-γ的能力[64,65]；另外一种观点则认为Tim-3抑制NK细胞的功能，支持性研究发现，在HIV感染的过程中，Tim-3通路抑制NK细胞的功能，使其抗病毒能力减弱[66,67]。

HBV的相关研究发现，Tim-3通路参与调控NK细胞的功能。在CHB患者和HBV转基因小鼠模型中，NK细胞表达Tim-3上调，而且，NK细胞上Tim-3的表达水平与患者的ALT水平呈现正相关。阻断Gal/Tim-3通路能够恢复CHB患者NK细胞以及NK92细胞系分泌细胞因子IFN-γ的能力[51]。这些证据表明，在HBV感染过程中，Gal-9/Tim-3通路负调控NK细胞的功能。

综上所述，在固有免疫系统的调节中，Gal-9/Tim-3通路发挥着重要的调控功能，在HBV感染过程中，Tim-3在相关免疫细胞上表达上调，并起到抑制这些细胞功能的效应。但是，Gal-9/Tim-3通路在调节固有免疫细胞功能中的作用比较复杂，有待进一步的研究探索。

4 结语

在HBV感染及相关疾病中，Gal-9及Tim-3分子表达上调，参与调控机体的适应性免疫和固有免疫反应，提示Gal-9/Tim-3未来可能成为控制HBV感染的一个作用靶点，为HBV的治疗提供新的探索方向。然而，目前关于Gal-9/Tim-3通路在HBV中的作用机制并不明确，例如，HBV如何诱导Tim-3和Gal-9分子在多种免疫细胞中的表达上调？Gal-9/Tim-3通路激活后调控适应性免疫和固有免疫细胞功能的下游信号通路及具体机制是什么？而此通路在固有免疫中的调控作用，相关报道持相反观点，提示Tim-3通路在固有免疫的调节作用是多重而复杂的，需要进一步的研究探索。此外，Gal-9/Tim-3通路在对HBV感染中固有免疫调节中的研究并不充分，未来仍需进一步深入探究。