环状非编码RNA在口腔鳞癌中的研究进展

卫佳宁，续国强，高继萍，宋国华

(山西医科大学实验动物中心，实验动物与人类疾病动物模型山西省重点实验室，太原 030001)

口腔癌是世界上最常见的第十一种恶性肿瘤，尤其是在发展中国家，在发病总数中排名第九[1]。虽然随着医学技术的发展，口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)的死亡率保持相对不变。但统计发现口腔癌患者趋于年轻化，该癌症的总体预后较差，生存率约55%～65%[2]。这可能是由于延迟诊断，早期诊断是降低口腔癌死亡率的关键，目前寻找一种新的生物标志物和治疗目标是至关重要的。环状RNA(circular RNA，circRNA)在哺乳动物中广泛存在[3]，通过共价键连接3’和5’末端形成闭合环状结构的内源性非编码RNA[4]，因其闭环结构能够抗核糖核酸酶的降解，在细胞和组织的发育阶段能够稳定的表达[5]。一些研究发现，circRNA可参与RNA蛋白复合物的形成和RNA-RNA调控网络[6]，可作为一个病毒或病毒复制的模板，在RNA加工反应中作为顺式作用元件起作用，如snoRNA基因和miRNA海绵[7]。研究表明，circRNA参与一些疾病的发生发展[8]，尤其在肿瘤方面。因此，从circRNA角度研究口腔鳞癌致病机理及治疗方案具有重要意义。

1 CircRNA的生物合成、分类及作用机制

1.1 CircRNA的生物合成

CircRNA是前体mRNA(pre-mRNA)通过可变剪切加工产生，广泛且稳定地存在于所有的真核生物中的一类非编码RNA[9-10]。大部分的circRNA是由外显子序列构成，在不同的物种中具有保守性，同时存在组织及不同发育阶段的表达特异性。CircRNA也可以通过非经典剪接方式进行反向剪接形成。2013年，Jeck等[5]在《RNA》中提出circRNA产生的两种模型：套索驱动环化和内含子驱动环化。套索驱动环化模型认为pre-mRNA的转录过程中由于RNA发生了部分折叠，拉近了原本非相邻的外显子，从而发生了外显子跳跃，使得被跨越的区域形成了环形RNA中间体，进一步通过套索剪接形成由外显子构成的环形RNA分子。另一种模型认为，内含子区域的反向互补序列导致内含子区域配对，介导反向剪接，从而形成环形RNA分子[11]。

1.2 CircRNA的分类

环状RNA的产生多种多样，可来源于不同的基因，也可由同一基因产生。根据来源可以分为3类：存在于细胞质中仅由外显子构成的环状RNA(exonic circRNA)；置于细胞核中仅由内含子构成的环状RNA(intronic circRNA)[12]；包含外显子之间的内含子的circRNA(exon-intro circRNA)[13]。

1.3 CircRNA的作用机制

CircRNA最初被认为是mRNA拼接错误的副产品，具有稳定、多样化和保守的特点。近期研究显示，circRNA在不同物种中起到miRNA“分子海绵”的作用，称之为竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)，能竞争性结合疾病相关的miRNA，解除miRNA对其靶基因的抑制作用，上调靶基因的表达水平，从而在疾病调控中发挥重要作用。CircDOCK1通过作为ceRNA调节BIRC3表达并参与OSCC细胞凋亡的过程[14]。Circ_100290通过充当miR-29的“分子海绵”在口腔癌中发挥作用[15]。CircHIPK3作为miR-124海绵，调节靶标水通道蛋白3(AQP-3)表达，AQP-3进而促进细胞增殖和迁移[16]。CircRNA也可与lncRNA竞争性结合miRNA。Li等[17]通过GO分析和KEGG分析发现，在生殖干细胞中lncRNA Meg3和cirRNA Igf1r可以与miRNA-15a-5p竞争结合增加靶基因InhA、ACSL3、KIF21B和IGFBP2的表达。这些发现为lncRNAs和circRNAs提供了新的视角，为将来对生殖干细胞中lncRNAs和circRNAs调控机制的研究奠定了基础。

2 CircRNA与口腔鳞癌

2.1 口腔鳞癌中充当miRNA海绵作用

CircRNA可以与miRNA结合，从而阻止miRNA沉默，因此circRNA也称miRNA海绵[18-19]。有研究表明[3, 7, 14-15]，circRNA_100290、circDOCK1、circRNA BANP和circRNA ITCH在口腔癌中通过miRNA的海绵参与发病机制。

2.1.1 CircRNA_100290

Chen等[15]使用微阵列分析对OSCC中的circRNA进行了全面研究，鉴定出在OSCC组织和非癌组织之间差异表达的circRNAs，发现circ_100290在OSCC发展中起着重要的调节作用。CircRNA_100290在口腔癌组织中表达上调，通过充当miR-29家族成员的“分子海绵”来调节基因表达。CircRNA_100290与OSCC细胞在体外和体内的增殖相关。他们还发现circRNA_100290在OSCC组织中上调并与CDK6共表达。通过使用circRNA_100290特异性小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)敲低circRNA_100290的表达水平，检测OSCC细胞系中G1/S期阻滞，抑制细胞增殖并降低CDK6的表达。通过荧光素酶报告基因检测，观察到circRNA_100290直接与miR-29家族成员结合，包括miR-29a、miR-29b和miR-29c。进一步EGFP/RFP报告分析显示CDK6是miR-29b的直接靶标。总之，circRNA_100290可能作为ceRNA通过抑制miR-29b家族成员来调节CDK6表达。这表明circRNA可能在OSCC中发挥调节功能，可作为OSCC治疗的潜在靶点。进一步的研究显示circRNA_100290通过携带miR-29家族成员来发挥其调控功能，以减少CDK6的表达，CDK6也直接被miR-29家族靶向。它表明circRNA_100290和CDK6 mRNA是由miR29家族连接的一对ceRNA。

2.1.2 CircDOCK1

CircDOCK1为环状RNA鸟苷酸交换因子，先前有研究显示[20]通过TGF-β处理，circDOCK1的表达降低，而circDOCK1的靶基因mRNA表达增加2倍。此外TGF-β处理可以诱导上皮间质转化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)，表明circDOCK1的功能之一可以诱导上皮细胞mRNA下调，从而保持细胞稳定性。Wang等[14]通过用TNF-α刺激CAL-27细胞建立凋亡模型，使用高通量微阵列从细胞凋亡模型和正常CAL-27细胞中获得差异表达的circRNA谱，发现has_circ_100721(circDOCK1)过表达并且敲低circDOCK1表达水平可导致细胞凋亡率的增加。他们利用多种生物信息学方法，预测了circRNA、miRNA和基因之间的相互作用，并构建了circDOCK1/miR-196a-5p/BIRC3网络，确定circDOCK1与miR-196a-5p通过与BIRC3竞争，最终调节细胞凋亡而相互作用。用siRNA沉默circDOCK1和模拟物上调miR-196a-5p的表达，导致OSCC细胞中细胞凋亡增加并减少BIRC3形成，并通过qRT-PCR方法比较口腔鳞状细胞癌组织及癌旁组织中的circDOCK1，miR-196a-5p和BIRC3的表达进一步证实了此结果。最后得出结论，circDOCK1通过在OSCC中靶向BIRC3抑制miR-196a-5p来抑制细胞凋亡。

2.1.3 CircRNA BANP和circRNA ITCH

研究人员一直在探索控制牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSC)成骨分化的分子机制。研究表明，circRNA参与成骨分化[3, 7]。CircRNA BANP和circRNA ITCH分别为环状RNA酸性神经肽和环状RNA泛素连接蛋白。CircRNA BANP和circRNA ITCH可能与miRNA-34a和miRNA-146a相互作用以通过MAPK途径调节PDLSC成骨分化。虽然有数种lncRNAs、circRNAs和miRNAs被认为参与了PDLSC成骨分化，但是关于它们潜在的网络和功能的数据并不多。为了充分了解ceRNA对PDLSC成骨分化的影响，整合lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA竞争性调控网络至关重要。利用Illumina HiSeq2000开发RNA测序(RNA-seq)，以全面鉴定正常和成骨诱导性PDLSCs中差异表达的lncRNA和circRNA。使用qRT-PCR进一步证实了代表性的lncRNA和circRNA。最后，基于miRanda预测了lncRNA、circRNA、miRNA和mRNA的ceRNA网络，并通过GO分析和KEGG分析研究了它们的潜在调控作用。CeRNA网络表明，TCONS_00212979、TCONS_00212984、circRNA BANP和circRNA ITCH可能与miRNA-34a和miRNA-146a相互作用以通过MAPK途径调节PDLSC成骨分化[21]。研究结果可能为探索PDLSC成骨分化的分子机制提供新的证据。

2.2 转录调节作用

Li等[22]研究发现，在人类HeLa细胞中存在与RNA聚合酶II相关的circRNAs。在这些circRNA中，外显子被环化，内含子在外显子之间“保留”，可称它们为外显子-内含子circRNA或EIciRNA(exon-intron circRNA)。EIciRNA主要定位于核内，与U1 snRNP相互作用并促进其亲本基因的转录。他们的研究结果揭示了circRNA在调节细胞核中基因表达中的新作用，其中EIciRNAs增强其顺式的亲本基因表达，并突出了通过U1 snRNA和EIciRNAs之间的特定RNA-RNA相互作用进行转录控制的调控策略[22]。

2.3 生物标志物

据报道，circRNA BANP和circRNA ITCH有助于致癌并可能作为癌症生物标志物[23-24]。CircRNA_100290作为miR-29家族成员的海绵起作用，在口腔癌中起到CDK6的ceRNA的作用[15]，circDOCK1通过作为ceRNA调节BIRC3表达并参与OSCC细胞凋亡的过程[13]。因此，circRNA_100290和circDOCK1可能成为OSCC的新型潜在生物标志物和治疗靶点。CircRNA参与多种病理状态，包括神经系统疾病[25-26]、血液病[27]、软骨退化[28]、先天性巨结肠病[29]和多种癌症，这可以作为有前途的诊断生物标志物和治疗靶点。与miRNA和lncRNA相比，circRNA具有序列保守性，生物学稳定性和组织特异性特点，因此circRNA被认为是有希望的生物标志物和治疗靶点，并且可能在基因表达的调节中发挥潜在的功能。

3 展望

近几年来，circRNA具有充当miRNA分子“分子海绵”、调控基因转录、与蛋白质相互作用、吸附蛋白质以及参与蛋白质的翻译等功能，且能稳定存在于血清等特性。虽然目前对circRNA的研究并不是很多，但随着RNA测序技术的迅速发展，circRNA这个未来之星在口腔鳞癌的诊断和预后治疗方面有很大的发展前景。从circRNA入手挖掘新的生物标志物及circRNA在口腔中的潜在功能有助于口腔癌的早发现、早治疗。目前部分circRNA已被证实与肿瘤的发生、侵袭、转移和患者的预后相关。随着生物信息学方法及实验技术手段不断成熟，大数据分析的广泛应用，挖掘新数据、筛选具有生物标记的circRNA、结合circRNA-miRNA-mRNA机制及circRNA-lncRNA-mRNA机制分析疾病通路对于研究口腔鳞癌发生发展进程具有广阔的发展前景。