酸敏感离子通道1a在自身免疫性疾病发病机制中的研究进展

陈 勇，葛金芳，陈飞虎

(安徽医科大学药学院，安徽 合肥 230032)

酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)是退化/上皮钠通道家族的质子门控亚群，是由胞外H+激活的阳离子通道，它是由不同亚单位组合成的三聚体蛋白复合体[1]。到目前为止，已经鉴定了由4种基因编码产生的7种ASICs异构体：ASIC1a、ASIC1b、ASIC1b2、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、ASIC4。ASIC1a是ASICs的关键亚基[2]，在中枢外周多种疾病的病理生理过程中的作用被不断发现。ASICs的家族成员在很大程度上对Na+可通透，只有ASIC1a 对Ca2+可较小程度通透。酸碱平衡是机体维持正常生理活动的必要条件，缺血、缺氧、炎症引发的多种疾病都伴有组织酸化特征。ASIC1a 是胞外感受质子的关键受体，而酸中毒介导的细胞损伤与其对Ca2+的激活密不可分。ASIC1a因其广泛的生物学功能与重要的病理学意义成为近年来研究的热点，本文就其在自身免疫性疾病中发生发展过程中作用的研究进展做一综述。

1 ASIC1a 的基本生物学特征

1.1ASIC1a的结构ASIC1a是由500多个氨基酸组成，包含2个疏水跨膜结构域 (TM1和TM2) 、1个大的富含半胱氨酸的胞外环，其N端和C端均在胞内，3个亚基是形成功能性通道所必需的。肽类毒素除了可以验证ASICs在伤害感受和疼痛感觉中的作用之外，还可用于捕捉ASICs在药理学、生物物理学和结构研究的特定构象状态。德克萨斯州的珊瑚蛇毒素MitTx是一种异二聚体多肽毒素，它以不依赖pH的方式以纳摩尔浓度激活ASIC1a通道，为选择性ASIC1a强受体激动剂。Baconguis等确定了具有最小功能活性的ASIC1a和MitTx的共晶结构，并捕捉到开放状态ASIC1a的结构。同时，ASIC1a-MitTx复合物阐明了MitTx的作用机制：TM2具有不连续的α螺旋结构，其中Gly-AlaSer采用呈带状构象延伸的选择性过滤结构，通过相邻亚基交换细胞质的1/3的TM2。选择性过滤器的Gly 443残基提供3个羰基氧原子的环，为水合离子提供了能量屏障[3,7]。

1.2ASIC1a的组织分布ASIC1a是ASICs的关键亚基，广泛表达在中枢以及外周神经系统。ASIC1a主要分布于中枢的大脑皮质、海马、小脑、松果体、杏仁核、脊髓等部位[4]。Jahr等[5]发现，在分离的人单核细胞和分化的破骨细胞中也有ASIC1a表达，其在人软骨细胞中表达最为丰富。本课题组前期采用RT-PCR和Western blot研究发现，在大鼠关节软骨细胞中存在ASIC1a、ASIC2a、ASIC3 mRNA及蛋白的表达，且在佐剂性关节炎大鼠关节软骨细胞中高表达，其中ASIC1a表达水平明显高于其它亚基[6]。这提示ASIC1a在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)发生发展的机制中可能作为新的靶点起关键性调控作用，这也为RA的治疗提供新的途径。

1.3ASIC1a的生理学特性Chu等[7]研究显示，同聚体ASIC1a通道半数最大激活pH(pH for half-maximal activation， pH50)介于6.2和6.8之间。当培养基中细胞外pH从7.4迅速下降到较低水平时，小鼠纹状体的中等多棘神经元(medium spiny neurons, MSNs)触发瞬时内向电流。 ASICs活化的剂量-反应曲线显示pH50值为6.25，与同聚体ASIC1a通道的pH50值相当。同时，MSNs中的ASICs电流具有接近+60 mV的反转电位，有线性电流-电压关系，表明MSNs中的ASICs是Na+选择性的。

1.4ASIC1a的通道阻断剂阿米洛利可以阻断ENaC Na+/H+交换体和Na+/Ca2+交换体，曾经被用作利尿剂，是ASICs的非特异性阻断剂，其抑制ASIC1a、ASIC1b和ASIC2a电流的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)约为10～20 μmol·L-1，抑制瞬态ASIC3电流的IC50约为60 μmol·L-1。目前，阿米洛利是用于研究ASICs功能的主要药理学工具药之一。PcTx-1是一种从南美洲狼蛛毒素中纯化的多肽，可以通过促进ASIC1a的脱敏状态，特异性地有效抑制同聚体ASIC1a电流，是ASIC1a相关科研实验中常用的工具药[8]。

2 ASIC1a与自身免疫性疾病

2.1ASIC1a与类风湿关节炎RA[1,5-6]是一种以慢性、炎症性、系统性为特征的自身性免疫性疾病，其基本病理改变为滑膜炎、关节软骨及其下骨会被增生滑膜侵蚀，最后演变为关节畸形，进而导致功能丧失。不确切的病因和尚未阐明的发病机制成为RA临床诊断治疗的难题。关节软骨破坏作为其致残的根本原因，也成为寻找RA发病机制的研究热点之一。研究表明，ASIC1a在人及大鼠关节软骨中表达，并在炎症状态下表达上调，提示 RA病程中存在ASIC1a通道的过度激活。目前，对ASIC1a在RA发生机制中作用的研究主要聚焦于细胞凋亡和自噬机制。

2.1.1ASIC1a参与调控RA病程中的细胞凋亡 细胞凋亡是由基因控制的细胞程序性死亡，可通过清除机体衰老或异常的细胞从而维持内环境稳态。研究表明，Ca2+可通过作用于线粒体凋亡通路、促进细胞色素C(cytochrome C, cyt-C)的释放和caspase-3的激活，参与凋亡早期的信号传导[9]。现有研究证实，RA发病中，关节软骨细胞过度凋亡造成软骨组织的破坏[10]。那么ASIC1a介导的Ca2+激活是否参与了此过程呢？本课题组研究发现[11]，在含Ca2+培养基的大鼠软骨细胞中，胞外酸化(pH 6.0)时增加细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)，并引起LDH释放，导致软骨细胞死亡。ASIC1a特异性阻断剂PcTx-1明显减少这种[Ca2+]i的增加，并抑制酸诱导的大鼠关节软骨细胞损伤，表明增加[Ca2+]i可能通过ASIC1a介导。进一步研究证实[12]，在小分子干扰RNA介导AA大鼠关节软骨细胞ASIC1a表达沉默模型中，ASIC1a及其蛋白表达明显减少，关节软骨细胞的凋亡率和凋亡水平明显降低，同时关节软骨细胞II型胶原和蛋白聚糖表达明显增加，提示沉默ASIC1a能明显抑制胞外酸化刺激条件下AA大鼠关节软骨细胞过度凋亡而发挥保护作用。同时研究发现，阿米洛利能阻断ASICs，对酸诱导的软骨细胞凋亡有抑制作用，其机制可能是通过阻断ASICs抑制Ca2+超载，保护软骨细胞的线粒体功能，调节Bcl-2家族凋亡基因的表达，控制cyt-C的释放和 caspase凋亡执行蛋白的活性来实现的[10]。因此，阻断ASIC1a介导的Ca2+超载，抑制关节软骨细胞过度凋亡发挥保护作用，使ASIC1a有望成为RA 关节软骨过度损伤治疗的新的潜在靶点。

2.1.2ASIC1a参与调控RA病程中的细胞自噬 自噬是一种参与降解细胞内物质的溶酶体途径，对外界各种复杂条件表现为适应机制，其对于细胞内稳态是至关重要的。在过去10年中，许多研究已经将自噬与癌症的起始和进展、自身免疫、炎症、代谢、退行性疾病的进展相关联[13]。本课题组[14]相关研究证实， ASIC1a参与介导的自噬在RA发生中起关键性调节作用：体外培养的大鼠关节软骨细胞在pH 6.0胞外酸化刺激下自噬水平明显升高，且自噬小体明显增多，ASIC1a 特异性阻断剂PcTx-1处理后可明显抑制自噬水平，且自噬体数量减少。进一步的机制研究揭示，与pH 6.0组相比，用 ERK1/ 2磷酸化抑制剂处理后，自噬相关基因 Beclin-1 mRNA和自噬蛋白LC3的表达均下调，差异具有统计学意义。这提示胞外酸化环境可以诱导关节软骨自噬的发生，ASIC1a特异性阻断剂PcTx-1对其抑制作用机制可能与抑制ERK1/2磷酸化有关。另有研究发现[15]，pH 6.0酸化刺激明显增加软骨细胞[Ca2+]i，自噬标志物 Beclin-1、ULK1 mRNA 及 LC3Ⅱ蛋白表达水平明显增高，且酸性自噬溶酶体形成增多，同时酸化刺激能引起 CaMKKβ及 pAMPK蛋白表达水平上升，磷酸化蛋白 p-mTOR水平明显降低。钙络合剂 BAPTA-AM可明显降低酸化组自噬水平和 CaMKKβ、 p-AMPK表达下降，p-mTOR表达明显升高。但ASIC1a 参与的胞外酸化环境诱导的关节软骨自噬的发生机制是否与其介导的Ca2+激活有关，仍有待进一步验证。

2.2ASIC1a与多发性硬化症多发性硬化症(multiple sclerosis, MS)是中枢神经系统进行性、自身免疫性、神经炎性疾病，其特征在于神经元脱髓鞘，患者自身免疫系统会对大脑、视神经、脊髓等神经细胞的髓鞘发起异常攻击[16]。脱髓鞘通过轴突阻断动作电位的传导，破坏突触前神经元的功能，并最终减少突触后细胞的活性。这类神经组织病变引起的炎症和组织损伤会导致一系列的系统症状，如肌无力、视觉损害，并最终导致残疾。尽管近年来有很多研究探讨其发病机制，但确切病因仍不清楚。电压门控K+通道阻滞4-氨基吡啶通过抑制神经元退化蛋白/上皮Na+通道，用于靶向治疗神经炎症疾病多发性硬化症，其中主要抑制在中枢神经元中表达的ASIC1a通道。Vergo等[17]通过ASIC1与轴突损伤β-淀粉样蛋白前体蛋白的共定位发现，在急性和慢性实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE)、MS脊髓和视神经组织的炎症损伤中，ASIC1在小鼠和人类神经元轴突中表达均增强，提示ASIC1的表达与轴突损伤相关联。Friese等[18]实验证实，在中枢神经系统炎症性病变中ASIC1活化导致轴突变性。在诱导的EAE小鼠模型中，ASIC1-/-与野生型小鼠相比，临床缺陷和轴突变性均明显减少。这与酸中毒介导的损伤一致，EAE小鼠脊髓中的pH测量结果显示，组织酸中毒激活ASIC1。阿米洛利在神经外植体和EAE小鼠模型中同样具有神经保护作用，可以明显减少EAE小鼠的轴突变性，保护髓鞘和神经元免受损伤，提示ASIC1阻断剂可以在多发性硬化中提供神经保护。Arun等[19]进一步临床研究证实，在进行性多发性硬化患者的慢性脑损伤中，轴突中ASIC1过表达与慢性失活损伤中的损伤标记物相关联，且阿米洛利对此有神经保护作用。在对14名初期进行性多发性硬化患者连续磁共振成像扫描3年试验显示，与预治疗期相比，阿米洛利治疗期间全脑体积的标准化年率明显降低，主要临床相关白质(胼胝体和皮质脊髓束)和深层灰质(丘脑)结构内组织损伤的扩散指数明显减少。MS发病机制复杂，ASIC1a 在MS患者和动物模型上的多种发现有助于更好地理解其病因及发病机制，其抑制剂或为其治疗提供新思路。

2.3ASIC1a与1型糖尿病1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)是机体自身体液和细胞免疫应答反应异常，胰岛β细胞选择性破坏导致胰岛素缺乏引起的慢性免疫性疾病[20]。T1DM由于病因复杂得到研究者普遍关注，目前研究主要集中于遗传因素和环境因素，如病毒感染、毒物等，其他发病机制的研究发现也越来越多。在过去几年中，ASICs被视为缺血或炎症相关过程中的关键感受器。其中，背根神经节中的局部微血管缺血在糖尿病性周围神经病中起重要作用，然而，ASICs在T1DM中的重要意义尚不清楚。近年来，在对T1DM的实验研究中发现，胰岛素能够维持ASIC1a在细胞外膜中的低表达，且 ASIC1a电流动力学似乎受糖尿病状况的影响最大，电流快于正常血糖条件下的2倍[21]。同时研究结果显示，当使用无胰岛素培养基时，胞内的ASIC1a大量转移至细胞膜上，从而放大ASIC1a通道介导的病理生理效应。使用特异性阻断剂证明ASIC1a通道的不同活性位点受T1DM的影响，PcTx-1能够降低其对ASIC1a结合位点的亲和力并增加其失活时间常数。炎症痛模型中的脑源神经营养因子也具有类似的膜转运效应，可促进ASIC1a从胞内到细胞膜的转运[22]。在小鼠T1DM模型中，Radu等[23]进一步证明，神经元中ASIC1a表达百分比的增加可能是ASIC1a膜转运对低胰岛素水平响应的结果，PI3K活化导致ASIC1a膜转运增加，其膜转运机制可能是胰岛素通过PI3K/Akt途径介导其对ASIC1a的作用。我们相信，随着研究的不断深入，有关T1DM中ASIC1a膜转运的相关机制及其生理病理意义将得到进一步的揭示。

2.4ASIC1a与其他自身免疫性疾病吴新安等[24]研究发现，在硝普钠诱导骨关节炎大鼠关节软骨细胞凋亡体外模型中，阿米洛利可明显降低大鼠关节软骨细胞凋亡率，同时凋亡阳性细胞数也明显减少，但其是否通过阻断ASICs发挥关节软骨保护作用，仍有待进一步证实。也有研究发现，ASIC1a在终止癫痫发作中具有关键作用。众所周知，癫痫发作和神经元过度兴奋诱导脑中pH水平的降低，在小鼠中干扰ASIC1a基因可增强癫痫发作的严重性，而ASIC1a基因的过表达则显示相反的效果。酸中毒诱导的ASIC1a激活通过促进抑制性中间神经元的功能来终止癫痫发作[25]。因此，ASIC1a激活剂可作为治疗癫痫发作的靶标。

3 结语与展望

自身免疫疾病是机体在应对自身抗原发生免疫反应时导致自身组织损伤所引起的疾病，过度活化的T、B细胞和随之伴随的慢性炎症反应引起机体多组织器官受损。然而，其病因和发病机制又较为复杂，可能与免疫耐受、遗传因素、病毒入侵机体造成损害等多种因素有关，对其确切诊断和治疗造成很大难题。ASIC1a作为细胞外质子的关键受体，参与涉及组织酸中毒的多种病理生理过程，其在自身免疫性疾病如RA、MS、T1DM等中的广泛而重要的生理病理学作用得到越来越多的研究者普遍关注。本课题组在RA动物模型和细胞模型中对ASIC1a参与的关节软骨损伤中的机制做了较为深入的研究，试图为RA发病机制及软骨损伤修复提供新的理解思路。同时，越来越多的ASICs抑制剂不断被研制出，但其选择性抑制剂和能推向临床应用的抑制剂仍有待进一步发现研制，以ASIC1a作为靶点将为自身免疫性疾病的治疗提供新的方向。目前，ASIC1a在自身免疫性疾病中的研究仍处于起始阶段，ASIC1a与自身免疫性疾病之间的联系需要进一步的揭示，其确切的临床意义及应用前景仍有待进一步的研究和探索。

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