牛双芽巴贝斯虫病PCR检测试剂盒研制

吴位珩万廷友刘镜孙启跃廖梅杨莉余波徐景峨*

（1，贵州省畜牧兽医研究所 550005；2，贵州省大方县动物卫生监督所 551600；3，贵州省畜禽品种改良站 550005）

牛双芽巴贝斯焦虫（Batesiosis Bigeminum）病是对牛危害较大的一种血液寄生虫病。据有关资料表明，牛双芽巴贝斯焦虫病在世界各地普遍存在，在我国，主要分布长江以南，有浙江、江苏、西藏、云南、贵州、江西、福建、广东、广西等省区。贵州省由于气候多温暖潮湿，适宜传播媒介蜱的生长发育，因此，牛双芽巴贝斯焦虫病分布于全省各地州市县，凡是引进纯种牛、杂交牛和本地牛混合饲养放牧的场所，极容易发生和流行此病，其感染率高达70～80%左右，给养牛业带来极大的损失。在该病诊断上，传统血涂片早期诊断，由于虫体含量低，难以在光学显微镜下分辨到，由于而且该病易与其他牛血液原虫（如附红体病、牛巴贝斯）混合感染，后期易继发出败感染，给确诊该病带来困难，对此，根据PCR原理建立起诊断牛双芽巴贝斯焦虫的PCR检测方法，自主研制出牛双芽巴贝斯虫PCR检测试剂盒，该试剂盒具有敏感、特异、快速简便的特点，此方法不失为牛双芽巴贝斯虫病临床诊断的好方法。

1 材料与方法

1.1 材料来源

采集贵州省某品种改良站感染发病的胚胎移植受体牛35头的全血各1ml，并加入酸性柠檬酸葡萄糖溶液B（既ACD）进行抗凝，1ml全血加入抗凝剂ACD的量为0.175ml，置于-20℃中备用。

1.2 参考菌株

牛双芽巴贝斯焦虫标准虫株DNA模板，由中国科学院兰州兽医研究所寄生虫病室惠赠。附红体、环形泰勒焦虫、巴贝斯焦虫DNA模板，均由本所畜禽疫病研究室采集病料提取的模板，-20℃保存备用。

1.3 引物的设计与合成

根据牛双芽巴贝斯焦虫热休克蛋白基因片段设计引物，PCR扩增出一长度为318bp大小的特异片段，该序列在Genbank上的登录号为AF332567.1。引物序列如下：

上引物：5’-CCC CTA TCA CCT TCA ACC-3’

下引物：5’-ACT GCG AGC ACT CAA TCC-3’

由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4 PCR试剂盒的组成

①红细胞裂解液；②TBS液；③蛋白酶K；④裂解液；⑤PCR酶；⑥DL2000 Marker；⑦引物；⑧阳性对照；⑨阴性

对

照；⑩TE缓冲液；⑪吸附柱。

1.4.1 红细胞裂解液组成

1.5M NH4Cl，100nM KHCO3，10nM EDTA-Na，用 1N HC1或1N NaOH调pH至7.2～7.4。

1.4.2 TBS液

10mmol/L的Tris含0.9%NaCl，用1N HCl调pH至7.4。

1.4.3 蛋白酶K

用TE溶液配制成20mg/ml。

1.4.4 裂解液

10mM的 Tris-HCL、1mM的EDTA、2.5M的NaCl以及占裂解液总体积5%的SDS组成的混合溶液。

1.4.5 TE缓冲液

10mM的Tris-HCL及1mM的EDTA组成的混合溶液，混合溶液的pH值为7.8。

1.4.6 PCR酶

10mM的Tris-HCL（PH8.3）、 50mM的KCl、 1.5mM的MgCl2 及 0.05U Polymerase/μl。

1.4.7 引物

上引物为 5’-CCC CTA TCA CCT TCA ACC-3’

下引物为5’-ACT GCG AGC ACT CAA TCC-3’

1.4.8 对照液

阴性对照为超纯水；阳性对照为牛双芽巴贝斯焦虫DNA模板。

1.4.9 清洗剂

体积百分比为70%的乙醇。

1.4.10 收集

采用吸附柱收集DNA模板。

1.5 全血中牛双芽巴贝斯焦虫DNA的提取

取1000μl全血于1.5ml的离心管中，10000r/min，离心2min，去上清；用1000μl生理盐清洗，10000r/min，离心2min，去上清，采用同样的方法共清洗3次，收集沉淀。在收集沉淀的离心管中，加入200μl的生理盐水和200～400μl的红细胞裂解液，充分摇匀，10000r/min，离心2min，去上清。在离心管中加入200μlTBS液、40μl蛋白酶K，摇匀，再加入160μl裂解液充分混匀，70℃水浴作用15-20分钟，取出，加入无水乙醇200μl，充分摇匀，然后倒入吸附柱里，离心2min，去上清，加入500μl清洗剂进行清洗，10000r/min，离心1min，反复清洗两次，然后将倒掉了清洗剂吸附柱10000r/min，再离心2min，取出吸附柱，置室温5min，将清洗剂完全晾干。再将吸附柱放入另一个干净的收集管中，加入 60～100μlTE 缓冲液，室温放置 2～5min，10000r/min，离心2min。为了获得更多的DNA模板，可将离心过的溶液再加在吸附柱里，同样室温放置2～5min，10000r/min，离心2min。然后将提取得到的DNA模板用加样枪转入存放DNA模板的离心管里。附红体、环形泰勒焦虫、巴贝斯焦虫DNA模板的提取，与上述方法相同。

1.6 特异性片段的PCR扩增

采用提取的DNA摸板，利用合成的引物在PCR酶的作用下进行扩增。反应体系和条件如下：PCR酶为10μl，双芽巴贝斯焦虫标准虫株DNA模板2μl，样本DNA摸板2μl，上下引物各1μl，加入ddH2O至25μl，在Tgradient96扩增仪下进行如下循环： 94℃变性3min，94℃35s，53.4℃35s，72℃40s，30个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后将扩增产物取7μl进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 PCR法扩增的特异性测定

分别用附红体、环形泰勒焦虫、巴贝斯焦虫DNA为摸板，进行PCR扩增。

1.8 PCR法扩增的敏感性的测定

采用TU-1800spc紫外可见光光度计，取OD值为260nm，将牛双芽巴贝斯焦虫DNA摸板稀释100倍，进行浓度的测量。 根据摸板浓度（μg/μl）=A260×稀释倍数×38/1000的方法进行计算。

1.9 重复性试验

应用建立的PCR方法，重复检测3次，检验牛双芽巴贝斯焦虫DNA样品结果的可靠性。

1.10试剂盒的保存期检测

将试剂盒在4℃、一20℃分别保存1个月、3个月、6个月、1年，对阳性样品进行检测，以确定试剂盒的保存时间。

2 结果

2.1 牛双芽巴贝斯焦虫特异性片段的PCR扩增

电泳检测显示约在318bp处，出现一条PCR目标带，其结果如图1所示，与预计结果非常接近。

2.2 PCR法扩增的特异性测定

分别用附红体、环形泰勒焦虫、巴贝斯焦虫DNA为摸板，进行PCR扩增，除牛双芽巴贝斯焦虫出现扩增带，其他的虫株未见特异性318bp片段扩增，结果如图2。

图1牛双芽巴贝斯虫特异性PCR扩增产物

图2 PCR特异性检测

图3 PCR敏感性检测

注：M为DNA Marker DL2000，1.412ng量DNA，2.41.2ng量DNA，3.4.12ng量DNA，4.412pg 量 DNA，5.41.2pg 量DNA，6.4.12pg量DNA，7.412fg量DNA，8.41.2fg量 DNA。

图4血样PCR检测结果

2.3 PCR法扩增的敏感性的测定

测得牛双芽巴贝斯焦虫标准DNA模板的平均OD260值为0.05433nm，根据模板浓度的计算方法进行计算，结果得实验提取的牛双芽巴贝斯焦虫标准DNA模板的含量为0.206μg/μl。在进行敏感性试验时，按对数稀释法对DNA模板进行稀释后，取2μl模板进行扩增，则牛双芽巴贝斯焦虫标准 DNA浓度依次为 412ng，41.2ng，4.12ng，412pg，41.2pg，4.12pg，412fg，41.2fg。可检出的牛双芽巴贝斯焦虫标准DNA模板的含量最小是41.2pg，即灵敏度为41.2pg，结果如图3。

2.4 重复性试验

应用建立的PCR方法重复检测3次，检验牛双芽巴贝斯焦虫DNA样品结果的可靠性。研制结果是应用建立的PCR方法重复检测牛双芽巴贝斯焦虫DNA样品3次结果均一致，结果如图4。

2.5 试剂盒的保存期检测

将试剂盒在4℃、-20℃分别保存1个月、3个月、6个月、1年，对阳性样品进行检测，以确定试剂盒的保存时间。研制结果4℃保存1年条带较淡，-20℃保存1个月、3个月、6个月、1年对条带亮度无影响。

3 讨论

（1）目前，集约化、规模化养牛业兴起，异地引种增多，流通交易频繁，加之饲养管理不善等原因造成牛双芽巴贝斯病的发生和流行，给养牛业的发展带来很大危害，对于早期确诊该病，有效地控制和预防该病发生和流行显得尤为重要。通过研究可以看到，PCR技术在牛结核病诊断上的应用是将该病的诊断提高到分子和基因水平，在诊断双芽巴贝斯焦虫病上较传统的检测方法具有更高的敏感性和特异性。而且整个实验过程仅需6h，从而有益于牛双芽巴贝斯焦虫病的早期诊断，这为预防和控制该病的发生和流行提供技术支撑，从而最大限度的减少改病给养牛业造成的损失，确保人畜健康。

（2）牛感染双芽巴贝斯焦虫后，机体抵抗力下降，受破坏的红细胞达到一定程度时会表现出临床症状，严重时造成死亡。因此，应采用牛双芽巴贝斯焦虫病PCR诊断方法对牛群进行早期诊断和治疗是控制该疾病发生和流行的有效措施，该检测方法较传统的抹片显微镜检测方法更具有实用性。

（3）由于牛双芽巴贝斯焦虫病必须依赖蜱叮咬而传播，预防上应杀灭养殖场周边环境牛体上的蜱以切断传播途径，有效预防和控制该病的流行和发生。引进牛及牛群做隔离检疫，牛尽量不从疫区引进，对发病牛应作隔离饲养，确诊为该病的牛要及时进行治疗，其首选药为贝尼尔，配合适量的抗生素、采用葡萄糖和VC进行补液，可提高疗效。