DDIT4对脑缺血再灌注损伤中自噬的调控作用*

张 怡， 高维娟

(河北中医学院河北省心脑血管病中医药防治重点实验室， 河北 石家庄 050091)

[中图分类号] R743; R363 [文献标志码] A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2018.05.030

脑卒中(stroke)是危害人类健康与生命的常见病和多发病，是造成我国居民死亡的首位原因[1]，其中缺血性脑卒中(ischemia stroke)的发病率及致死致残率更是居高不下，约占全部脑血管病的60%～80%[2]。脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)是缺血性脑卒中的重要病理生理过程，其发生发展受多种机制的调控，十分复杂，其中细胞自噬在其中扮演了重要角色。DDIT家族成员之一的DNA损伤诱导转录物4(DNA-damage-inducible transcript 4，DDIT4)参与压力应激、DNA损伤修复、细胞凋亡和细胞自噬等重要生命进程，可通过调控细胞自噬对CIRI的发生发展发挥重要的调节作用。

1 DDIT4的结构

DDIT4(又被称为RTP801、REDD1和Dig2)为DDIT家族成员之一，具有调节压力应激、DNA损伤修复、细胞凋亡及细胞自噬等作用[3]。2002年2个不同的团队首次发现并克隆了DDIT4，Shoshani等[4]在大鼠C6胶质瘤细胞中将其发现并命名为RTP801，而Ellisen等[5]克隆了一个参与ROS调控的基因，并将其命名为REDD1；2003年Wang等[6]在鼠淋巴瘤T细胞中发现dig2，并进一步研究发现其在多种细胞应激下表达迅速上调。

DDIT4基因定位于人染色体的10q24.33，能编码一种含有未知结构域的蛋白，全长2.12 kb，具有2个内含子和3个外显子，翻译起始上游有619 bp的启动子区域。除了人类，DDIT4同样存在于大鼠、小鼠、果蝇和非洲爪蟾蜍等生物中[7]。人和大鼠DDIT4 cDNA的一致性高达85%，具有很高的同源性，两者的ORF分别编码232和229个氨基酸;氨基酸序列分析表明，两者的保守性达到 90%，都含有17%的亮氨酸，并且N端存在9或10个保守的丝氨酸[8]。DDIT4蛋白广泛存在于人体的细胞质中，没有明显定位在某个细胞器中。正常情况下呈低水平表达，其蛋白半衰期为15～20 min，时间较短，很难被检测到。DDIT4的N端稳定性较差，其N端有84个对维持功能无关的氨基酸；相反其C端具有较高的保守性，含有RTP801-C蛋白结构域，C端只有几个残基与其功能的维持无关。研究发现DDIT4的N端具有Ser 19、 Thr 23、Thr 25和Ser 121几个潜在的磷酸化位点，其中Thr 23和Thr 25符合GSK3β磷酸化的保守序列，将T23/25A双位点突变，可使DDIT4的磷酸化水平显著降低。DDIT4的C端功能域有1个包含psi环状基序的α/β三明治结构，为新的拓扑结构，该结构对DDIT4信号通路发挥关键作用[9]。

2 DDIT4的表达调控

作为高度保守的应激反应蛋白，DDIT4的表达和调控受缺氧、DNA损伤、能量应激、营养消耗及内质网应激等多种细胞应激的影响[10]，多种因子及信号通路均可调控DDIT4的表达。DDIT4最早在缺氧研究中被发现，无论在体实验还是离体实验，缺氧均可导致DDIT4表达的迅速上调。DDIT4曾被认为是低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)的直接转录靶点[11]，其启动子区域发现-454到-434为HIF-1反应元件，说明在缺氧情况下，作为HIF-1的反应基因，其表达受HIF-1的调节[11]。除HIF-1外，研究证实DDIT4的表达同时还受磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, PKB; 即Akt)通路的调控，Schwarzer等[12]通过对PC-3细胞的研究发现，RTP801(DDIT4)的表达可被PI3K/Akt通路的抑制剂LY294002阻断，将PI3K功能亚单位P110β的反义寡核苷酸转染至PC-3细胞，能够有效抑制PC-3细胞RTP801蛋白的表达。AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)对DDIT4的表达也具有重要的调控作用，Zannella等[13]通过电离辐射对小鼠胚胎成纤维细胞的研究发现，REDD1(DDIT4)的转录诱导及蛋白质表达需要AMPK的参与，电离辐射可通过减少AMPK的表达导致REDD1的正确诱导失败从而使哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)激活。DNA损伤时，DDIT4的表达受p53的调控，在DDIT4转录起始位点上游600 bp处存在一个p53结合位点，提示REDD1是p53的直接靶基因。另外，Ellisen等[5]研究认为RTP801的表达受 p63通路的调控，为p63通路的一个靶基因，在小鼠发育过程中，RTP801的作用与p63密切相关。但此观点受到了Schwarzer等[12]的质疑，他们发现p63的阻断剂并不能阻断RTP801在HaCaT细胞中的表达。Lin等[14]发现，突变诱导剂砷可通过活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)诱导RTP801启动子活性升高，细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的激酶(ERK kinase，MEK)抑制剂PD98059能明显抑制砷的这种诱导作用。

3 自噬在脑缺血再灌注损伤中的“双刃剑”作用

自噬是广泛存在于真核生物细胞内的一种细胞自我吞噬现象，是细胞在生理或病理因素作用下，由内质网或高尔基体等来源的双层膜包裹异常蛋白质或细胞器形成自噬小体，并与溶酶体逐渐融合形成自噬溶酶体，在溶酶体酶的作用下，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新[15]。CIRI后大量ROS和自由基等所引起的氧化应激是引发自噬的重要诱因[16]。研究发现，细胞在饥饿和低氧等情况下适度激活自噬，不仅能通过降解蛋白提供能量，而且能够通过降解损伤的蛋白后合成新的蛋白，对机体细胞起保护作用；然而自噬若被过度激活则可导致细胞裂解和促进细胞死亡，即自噬性细胞死亡，这种自噬性细胞死亡常伴随细胞凋亡和细胞坏死[17]。自噬在细胞损伤中发挥着“双刃剑”的作用，在CIRI中也不例外，CIRI中细胞损伤的严重程度直接关系到自噬在脑缺血性损伤中的作用。Puyal等[18]、Carloni等[19]和Sheng等[20]的研究均认为细胞自噬能够缩小CIRI后梗死体积，减少神经元死亡，减轻神经功能障碍，起到减轻缺血再灌注损伤的作用。而Wen等[21]和Shi等[22]的研究则发现自噬的过度激活会导致神经元的死亡，加重CIRI后的脑损伤程度。

4 DDIT4对细胞自噬的调控作用

大量研究发现，DDIT4在细胞自噬过程中发挥了重要作用，其表达不仅受PI3K/Akt-mTOR、AMPK、p53和MEK等信号通路的影响，同时DDIT4的表达对mTOR、AMPK-mTOR复合物1(mTOR complex 1, mTORC1)、MAPK等自噬信号通路也具有重要的反馈调控作用。

4.1DDIT4对mTOR信号通路的调控 mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，对细胞自噬可表现出“活性开关”样作用，通过感受细胞内外多种信号的变化，发挥激活或抑制自噬水平的作用，继而增强细胞对环境应激的适应性[23]。PI3K/Akt-mTOR信号通路在感受营养信号、调节细胞生长与增殖中起着关键性的作用。mTOR复合物包括mTORC1即雷帕霉素敏感型和mTOR复合物2(mTOR complex 2，mTORC2)即雷帕霉素欠敏感型，其中mTORC1是自噬的主要调节靶点。mTOR上游信号分子主要包括PI3K/Akt通路[24]，缺血性卒中发生后，脑缺血缺氧刺激激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPAR-γ)，抑制beclin l活性后，而后进一步抑制PI3K和Akt的活性，最终抑制mTORCl的激酶活性，激活自噬[25]。

DDIT4是mTOR自噬信号通路的负调节因子，其关键功能为能够有效抑制mTOR的活性[26]。正常情况下，DDIT4含量很低，mTOR处于激活状态。当CIRI后各种细胞应激导致DDIT4表达迅速升高，令mTOR和Akt循序失活[27]。表达升高的DDIT4竞争结合14-3-3蛋白，导致Tsc2/14-3-3复合体解聚，从而活化Tsc1/2抑制mTORC1的表达；这些事件导致蛋白质翻译抑制以及阻止Akt Ser473和Thr308位点的磷酸化[3]，最终导致自噬的激活。研究证实，当DDIT4被敲除后，会激活mTOR磷酸化，导致自噬起始的封锁，而p70S6K和Akt(Ser473)的磷酸化水平均显著升高，自噬受抑制[28]。

4.2DDIT4对AMPK-mTORC1信号通路的调控 AMPK是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是真核细胞内重要的“能量感受器”[29]。当细胞发生缺血、缺氧等应激反应时，升高的AMP/ATP比可通过提高Thr172的磷酸化激活AMPK。CIRI后为获取能量，细胞会启动依赖AMPK的自噬过程。AMPK下游最终作用底物是mTORC1，mTORC1活性不同对自噬的作用也不同，在生长因子及营养丰富状况下它的活性增强可以抑制自噬，反之亦然。研究发现AMPK可通过直接磷酸化Ser1345和Ser1227激活TSC2或通过GSK3β分子Ser1341和Ser1337间接激活TSC2，从而抑制mTORC1，促进CIRI后自噬的发生[30]。

作为缺氧诱导型应激反应基因，DDIT4对CIRI后AMPK-mTORC1自噬信号通路具有重要的调控作用。DDIT4为AMPK下游、mTOR上游因子，是mTOR的负性调节因子。在缺氧条件下，DDIT4的表达增加，并被激活的AMPK进一步增强，竞争结合14-3-3蛋白，导致Tsc2/14-3-3复合体解聚，从而活化Tsc1/2抑制mTORC1，AMPK则通过激活被DDIT4解聚的TSC2抑制mTORC1的活性，激活及增强细胞自噬[31]。Schneider等[32]研究认为AMPK对mTOR的抑制作用依赖其下游DDIT4的激活，DDIT4对mTORC1的抑制可通过AMPK/REDD1信号通路发挥作用；Zannella等[33]对细胞信号通路进行研究同样认为DDIT4可通过AMPK信号途径增强对mTOR的抑制。

4.3DDIT4对MAPK信号通路的调控 MAPK由ERK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38构成，mTORC1为其下游调节分子。研究证实，MAPK自噬信号通路在CIRI中发挥了重要作用。JNK是MAPK家族的重要成员之一，Lorin等[34]研究显示发现，大鼠脑缺血及再灌注损伤后JNK通路被激活，引起其下游Bcl-2的磷酸化，影响Bcl-2和beclin 1的结合，最终促进自噬发生。韦强等[35]对大鼠中动脉栓塞模型的研究发现，CIRI 24 h后ERK1/2表达明显增加，而自噬相关蛋白beclin 1表达显著下降，大鼠脑梗死面积增加。Zhang等[36]研究发现，p38信号通路促进自噬的发生，在缺血性脑病的研究中发现，通过抑制p38可以抑制自噬。

DDIT4的表达不仅受MAPK信号通路的影响，同时升高的DDIT4对MAPK信号通路的调控发挥了重要作用。Liu等[37]研究证实REDD1对MAPK信号通路具有抑制作用，REDD1敲出后会导致ERK1/2的磷酸化水平升高。但DDIT4对MAPK信号通路的具体调节机制尚不明确，仍需进一步研究探索。

5 小结

缺血性脑卒中是威胁人类健康的常见病、多发病，给家庭和社会造成了沉重负担。脑缺血再灌注损伤是缺血性脑卒中的重要病理生理进程，通过炎症反应、氧化应激、细胞自噬与凋亡等一系列级联反应对机体造成严重损伤。DDIT4是公认的细胞应激性蛋白，在缺氧、DNA损伤、能量缺乏等情况下表达迅速上调。研究发现DDIT4与细胞自噬关系密切，其表达升高可迅速激活自噬，并通过多条自噬信号通路对自噬的进程进行调控。细胞自噬是CIRI中的重要病理表现，CIRI中DDIT4因缺氧等应激刺激表达迅速上调，通过多条信号通路促进自噬的发生，并根据CIRI中细胞损伤的严重程度发挥保护或损伤的不同作用。目前关于DDIT4对CIRI中自噬的调控研究相对较少，其对CIRI中自噬的具体调节机制仍有待进一步探索，深入研究DDIT4对自噬的调控机制可能为研究CIRI的分子机制及其临床治疗提供新的切入点。

[参 考 文 献]

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