补阳还五汤对中性粒细胞胞外诱补网形成的血栓溶解作用研究进展

程旭希，孙 瑜，董倩楠，董鑫鑫，祁嘉莹

(天津中医药大学，天津 300100)

脑血管疾病尤其是脑缺血是威胁老年人健康的主要疾病，每年约有数百万人死于心脑血管缺血类疾病。而补阳还五汤则是广泛被应用于治疗或预防脑缺血类疾病的一方药剂。补阳还五汤出自清代大医王清任的《医林改错》[1]，此方中重用黄芪补气，辅用当归尾活血，使活血补气为本，通络疏瘀为标，标本兼顾。现代药理学也发现，此方可以改善血液流变动力学，具有抑制血小板聚集、保护内皮细胞、抑制凝血酶和相关蛋白的形成、抑制内皮因子的表达等作用。故临床多用此方治疗气虚血癖类疾病，如脑缺血、脑梗死、足、下肢深静脉血栓等，均取得很好疗效[2]。而其保护脑缺血机制的作用研究也成为近年来研究热点。

中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)与促进脑缺血疾病发生呈现一定的相关性。NETs是中性粒细胞活化时释放一种网状物质，具有细胞毒性和血栓形成的效应，参与多种疾病的病理过程[3]。本文就近四年来NETs介导的血栓形成机制与补阳还五汤的溶栓机制做一综述，旨在提出未来研究脑缺血疾病用药的新思路，为补阳还五汤治疗脑缺血再灌注损伤的后续研究提供相关理论支持。

1 NETs的概述

1.1NETs的介绍 中性粒细胞是肌体抵御病原微生物入侵的第一道防线，其吞噬入侵的细菌形成吞噬体。中性粒细胞除了具有传统的吞噬杀菌作用外，NETs是一种新的胞外杀菌形式[4]。NETs主要由DNA、组蛋白与细胞质内颗粒(源性)蛋白质构成[5]。其具有黏性，可以准确定位感染部位，这个性质对细菌、真菌和寄生虫等具有捕杀作用。属于一种重要的先天免疫应答机制。从基因层面上看，NETs中DNA是完整的，细菌等病原微生物被其束缚可无法在体内扩散。部分具有病菌分泌细胞外脱氧核糖核酸酶降解NETs，增加了致病毒力[6]。NETs还可以通过激活凝血途径，形成血凝块来减少病原体的扩散，然而其生成过多会引发多器官血栓形成，导致肌体重要脏器缺血，如不及时治疗将危及生命[7]。

1.2疾病对NETs的影响 血栓形成是恶性肿瘤的常见并发症之一，血栓性疾病已成为癌症患者致死的重要原因。据统计约10%～30%的恶性肿瘤在其发病过程中合并血栓发生。肿瘤细胞可直接损伤血管壁内皮细胞或者通过自身释放促凝物质皆可诱发血栓形成。但最近研究发现中性粒细胞也在恶性肿瘤相关血栓中发挥至关重要作用。在对合并静脉血栓栓塞症的多种恶性肿瘤患者(如肺肿瘤、肝肿瘤、大肠肿瘤、胃肿瘤)进行研究中，显示其外周血中性粒细胞计数明显高于未合并血栓的恶性肿瘤患者。Demers等[8]将荷瘤小鼠分成两组，一组加入Dnase，另一组作为阴性对照，然后观察两组小鼠血栓形成情况，结果显示加入Dnase组血栓形成的量明显少于对照组，这表明NETs与癌症相关血栓的形成有关系。

Megens等[9]证实，大鼠和人体动脉粥硬化斑块中有组蛋白生成。Borissoff等[10]发现，282个重度冠状动脉粥样硬化患者通过计算机层析冠状动脉成像技术证实其体内有大量的胞外dsDNA、核小体及MPO-DNA复合物存在，同时也证明重度粥样化患者循环中凝血酶的水平明显增加，并证实其血液中NETs含量和冠状动脉粥样化程度明显相关。Mangold等[11]发现，ST段抬高型急性冠脉综合症患者血管内DNA、组蛋白及MPO含量明显增多，且含量与梗死范围的大小成正相关。同时发现多形核白细胞被高度激活，同时与血小板形成复合物，此外也发现血管内DNA酶活性与梗死范围大小成负相关。Stakos等[12]发现，急性ST段抬高型心肌梗死患者血管斑块破裂处凝血酶活化的血小板和多形核白细胞间的相互作用会导致局部NETs生成，血管内组织因子的表达是通过NETs实现的。

NETs的形成使中性粒细胞染色质向免疫细胞暴露，因此免疫系统会产生针对中性粒细胞自身核酸的抗体，进而参与自身免疫性疾病的病理过程。尹晓雪等[13]引证ANCA可以活化肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)预刺激的中性粒细胞，致中性粒细胞产生NETs。ANCA作用于中性粒细胞表面的靶抗原蛋白酶3(proteinase,PR3)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)，可导致显微镜下多脉管炎及韦格纳肉芽肿发生。研究还发现，NETs中存在PR3和MPO,其是ANCA的特异性靶抗原，这使免疫系统进入一个恶性循环，进而加重小血管炎患者病情。小血管炎患者产生的NETs可将中性粒细胞靶抗原呈递给树突状细胞，进而参与免疫应答反应。与NETs形成需要活性氧产生的理论相一致，ANCA与中性粒细胞表面靶抗原结合，活化中性粒细胞的过程依赖中性粒细胞内呼吸链的活性氧释放，同时也为研究ANCA刺激中性粒细胞产生NETs奠定了理论基础。

1.3对NETs有影响的药物研究现状 目前对NETs形成机制研究较为全面，因此也衍生出了许多临床上药物研究对应的靶点。例如针对组蛋白-DNA复合物这个靶点，就有采用DNase即DNA降解酶处理的方法，实验结果显示此方法可有效减少后肢缺血再灌注小鼠的后肢肌肉纤维、血管、微血管内的NETs水平。再例如针对NETs形成过程中的酶类、激活氧化应激活性的信号酶与血小板活性抑制等，都可作为抑制NETs形成的潜在靶点[14]。

NETs对于恶性肿瘤的影响目前有研究表明，喜树碱可通过减少NE及MMP9蛋白的表达来发挥减少中性粒细胞进入肿瘤部位及参与肿瘤增殖作用[15]。乔艳婷等[16]通过使用PMA刺激PMN的方法提取NETs，使用DNase和肝素分别处理体外诱导的脐静脉内皮细胞，两组都出现内皮细胞活性降低被抑制的情况，但是肝素处理组抑制现象更明显。此研究表明，肝素能减轻由NETs导致的内皮细胞损伤。

不仅西药中具有某些活性成分可以作用于这些靶点，中药中可能同样具有减少NETs形成或加快NETs降解的某些活性成分。虽然目前有很多对于中药直接治疗缺血再灌注的研究，但中药直接对NETs作用的研究却很少。张庆光等[14]总结发现，番樱桃属中的酚类化合物可有效抑制NETs的形成，减轻炎症反应。还有研究表明雷公藤的主要活性成分之一雷公藤红素可有效地抑制NETs的形成和嗜中性粒细胞的氧释放，其主要机制是下调SYK-MEK-ERK-NF-KB级联信号。也有研究表明唇形科植物丹参内的二萜醌类化合物丹参酮ⅡA可显著抑制嗜中性粒细胞向类风湿炎症部位的聚集，减少MPO、NE的释放，并抑制NETs的形成。通过减弱嗜中性粒细胞的凋亡，减少炎症过程的延长与NETs的形成。可以推测，部分抗血栓形成的中药及其复方的作用机制可能包含对嗜中性粒细胞的调节作用，减少NETs形成或加快降解，发挥抗血栓形成的药效。

2 NETs与血栓形成

在目前血栓形成的研究中，中性粒细胞胞外诱捕网形成的相关机制对血栓形成的影响，越来越多的被人们所关注，总结出NETs与血栓形成之间的关系。

2.1刺激血小板的聚集 目前普遍认为NETs是一种大分子复合物，在血栓形成的过程中形成网状结构，引起血小板激活、黏附、聚集，作用类似νWf因子和纤维蛋白形成的网状结构。徐久元等[17]引证Fuchs进行的体外实验，用悬浮血浆的血小板灌注NETs，用电子显微镜观察发现血小板形成许多丝足，并牢固吸附于NETs，这表明吸附于NETs的血小板是活化的。后用全血灌注NETs，第1 min可见少许血小板积聚于NETs，后血小板黏附聚集NETs的纤维结构，过程达9 min以上。在第10 min后用DNA酶处理，会发现NETs和血小板的聚集被去除；如果在灌注前就在血液中放入DNA酶，则NETs会迅速降解，血小板也不会发生聚集。此实验表明，血小板确实是吸附于NETs的纤维结构之上。

2.2激活内皮细胞启动凝血 中性粒细胞在内皮损伤的部位聚集和激活被认为是血栓形成的诱因。NETs会导致内皮细胞损伤，据解梓琛等[18]研究发现，二精致苯基碘(DPI)会明显抑制这种损伤作用，可以间接说明内皮细胞的损伤会导致血栓的形成。

Gupta等[19]将活化的内皮细胞和中性粒细胞共同培养3 h发现，活化的内皮细胞可以释放白介素-8以诱导NETs的形成。且NETs相关蛋白酶或阳离子蛋白，如防御素和组蛋白，也诱导内皮细胞的凋亡。

最近有研究发现，NETs中的基质金属蛋白酶-9通过活化内皮细胞中的基质金属蛋白酶-2也可诱导内皮细胞损伤，从而促进血栓形成[32]。

2.3增强凝血酶及凝血酶依赖的纤维蛋白生成 NETs可通过血小板依赖性途径和非依赖途径增强凝血酶的生成，进而促进血液凝固。NETs中的组蛋白H3、H4可直接激活血小板，增加血小板的黏附、聚集，易形成血栓[20]。NETs又可促进凝血酶依赖性的纤维蛋白生成，也可结合到vWF、纤连蛋白及纤维蛋白原上，加速血液凝固。NETs中的组蛋白可以促进凝血酶的生成，使得可溶性纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白，加快血液凝固。

2.4促进组织因子的生成 NETs在形成过程中可产生并释放出组织因子，而组织因子可以激活凝血级联反应。此外，NETs中含有的NE成分能够降低组织因子通路抑制剂(TFPI)的活性，这进一步加强了组织因子促凝的作用。因此，组织因子亦可能是NETs促进血栓形成的可能机制之一[21]。

研究还发现，TF与高亲和力的Ⅶ因子(factorⅦ,FⅦ)相结合,形成TF/FⅦa的复合物,并促使无活性的FⅦ变成有活性的FⅦa。除此之外,TF还可增加FⅦa和TF/FⅦa的蛋白水解酶和淀粉酶活性,使Ⅹ因子(Fx)转变为FⅩa,进而使纤维蛋白原变为纤维蛋白,完成外源性途径的凝血过程[22]。

3 补阳还五汤的溶解血栓的作用

3.1抑制血小板的聚集作用 血栓的形成是一个逐渐进展的过程，当肌体血小板活化后，其膜表面蛋白结构发生改变，血浆中相应受体与之结合，促进血小板聚集，加速血栓的形成。李振华[23]研究表明，补阳还五汤是通过调节血清血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)和6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)的比例，来抑制血小板的聚集，减缓血栓的形成。将75只健康SD雄性大鼠随机分为对照组、假手术组、模型组、西药组和中药组各15只，对照组、假手术组大鼠、模型组大鼠给予生理盐水灌胃;西药组大鼠给予氯吡格雷灌胃(7．0 mg/kg);中药组大鼠给予补阳还五汤灌胃(20 g/kg)。所有大鼠连续喂养14 d，第15日建立脑缺血再灌注损伤大鼠模型;测定各组大鼠TXB2和6 keto-PGF1α水平、凝血指标、血小板聚集率、血小板聚集抑制率以及血栓形成时间。结果:正常组与假手术组大鼠各项指标比较，差异无统计学意义(P>0．05);与对照组和假手术组比较，模型组血清TXB2升高、6-keto-PGF1α降低，补阳还五汤组抑制了血小板的聚集，减缓血栓的形成。

3.2保护血管内皮细胞功能 补阳还五汤组方中的黄芪能够不同程度地促进血管内皮细胞游走与增生，提高内皮细胞表面整合素活性，具有较好的促进血管生成和刺激NO生成作用，降低区域血管阻力，保护内皮细胞，改善微循环;而组方中其他单味药也通过对内皮细胞受损后所表达的促栓因子(如TXAz,ET等)的影响，保护内皮细胞的功能[24]。

对补阳还五汤进行拆方研究，发现补气药及活血药均可减轻血管损伤程度抑制血浆PAI活性。活血药可显著降低血浆ET含量;补气药可显著提高血浆t-PA活性，血浆t-PA及其抑制物PAI是反映体内纤溶性的重要指标,在血栓形成后,其含量有明显的变化,表现为t-PA活性下降及PAI活性的增高,模型组动物已表现出这种变化。补阳还五汤显著地提高了血浆t-PA的活性并降低了PAI的活性,其中补气药对t-PA、PAI均有影响,而活血药对t-PA未显示影响,却较明显地降低PAI的活性[25]。

3.3抑制凝血酶和相关蛋白的形成 蛋白C系统由凝血酶调节蛋白、蛋白C(PC)和蛋白S(PS)组成,具有较强的抗凝活性,约占全血抗凝活性的20%～30%。蛋白C是一种维生素K依赖蛋白,平时以无活性酶原形式存在于血浆中,被激活后通过灭活凝血因子Ⅴa和Ⅷa及促进纤维蛋白溶解而发挥抗凝抗栓作用。在一些血栓病患者，如DIC、脑梗塞,可见到PC活性降低,这可能是在血栓形成时PC消耗过多所致。唐映红等[26]研究结果表明,模型组血浆PC活性有所降低,表明本模型由于凝血系统激活,导致消耗一定的PC,从而使血中剩余的PC有所降低。低分子肝素可使PC活性显著升高,可能是低分子肝素通过激活AT-Ⅲ途径灭活凝血因子,从而使PC消耗减少所致。补阳还五汤组PC活性也高于假手术组,呈现出与低分子肝素类似的作用,其机制可能与肝素类似。生物碱组既可使AT-Ⅲ活性降低,又可使PC活性降低,推测生物碱中某些成分既具有类似肝素的作用,又可促进PC对凝血因子的灭活,使血中PC消耗增加。噻氯匹啶对PC活性无显著影响,提示其作用与抗凝系统无关。而苷对AT-Ⅲ活性无影响,但可使血浆PC活性升高,推测苷可能对凝血因子发挥直接的抑制作用,或通过其他途径促进了凝血因子的灭活,使血中PC消耗减少。所以补阳还五汤可以抑制血栓形成。

3.4抑制内皮因子的表达 在动脉栓塞类疾病中，血管内皮细胞受损大多是作为血栓形成的基础的。血管内皮细胞会合成及分泌一些抗凝抗栓物质[27]，并且还会表达TF来参与到凝血与形成血栓的过程中。欧明娥等[28]通过对血管内皮细胞研究得出以下结论。TF是通过作为因子Ⅶ(Ⅶa)的辅因子启动外源性凝血过程进而发挥作用的。TFPI是一种Kunitz丝氨酸蛋白水解酶抑制剂,通过结合并灭活Ⅹa因子,及与TF-FⅦa复合物结合Ⅹa因子形成TF-FⅦa-FⅩa-T FPI复合物来抑制凝血酶和纤维蛋白的产生。该实验结果表明，生物碱(1、2 mg/ml)、苷三个剂量、原方三个剂量TF表达均低于凝血酶组。凝血酶刺激后,TF、TFPI m RNA表达均增强,提示凝血酶刺激VEC后,可使VEC产生反应性变化,TF和TFPI表达增强。表明补阳还五汤及生物碱、苷对凝血酶诱导的TF表达具有抑制作用,可在转录水平抑制TF表达,从而抑制凝血酶导致的VEC促凝活性增强。而由于在转录过程中被抑制，则导致了VEC的促凝作用被抑制，自然地产生了抗血栓的效果。

4 治疗现状

焦玉冯[29]临床观察中，选取中风偏瘫患者中的40例患者进行常规康复训练治疗为参照组，10例患者在康复训练的同时加以补阳还五汤展开医治为研究组。治疗后，研究组患者的上下肢运动评分升高程度优于参照组，临床疗效也明显高于参照组。

周婧[30]对接受治疗的共76例脑卒中后急性期肩手综合征患者随机分为研究组与对照组各38例。两组均行康复训练治疗，研究组加用加味补阳还五汤治疗。两组治疗后肩手部肿胀积分、疼痛评分、上肢运动功能均显著优于治疗前(P<0.05)，且研究组优于对照组(P<0.05)，说明加味补阳还五汤结合康复训练可明显改善脑卒中后急性期肩手综合征，并且疗效显著。

李亚等[31]选取脑梗死患者50例，运用随机双盲法分为两组，对照组25例、观察组25例，对照组给予常规康复治疗，观察组在对照组基础上联合中药加味补阳还五汤，比较两种方案对脑梗死患者恢复过程的价值。治疗前观察组25例患者NIHSS评分与对照组对比，差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后观察组NIHSS评分显然高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗前两组数据对比，差异无统计学意义(P>0.05)；经治疗观察组改良MAS评分明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。两组治疗前生活能力评分比较，差异无统计学意义(P>0.05)；观察组治疗后ADL Barthel指数评分明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。此结果表明对脑梗死患者运用中药加味补阳还五汤方联合康复治疗，对患者的肌肉张力有明显改善，并且可以提高患者生活质量，非常适合用于临床治疗。

血管栓塞类疾病是目前高发的疾病，由文献和补阳还五汤的溶栓机制与NETs促进血栓形成的机制有着很大的契合度。不难推测，补阳还五汤很有可能是通过调整或缓解这些血栓形成的机制来溶解血栓的。例如，对于凝血的激活，致使局部血管闭塞，导致凝血异常，从而引起血栓的形成，中性粒细胞胞外诱捕网是根本原因。而补阳还五汤可从多方面抑制凝血的发生，进而抑制血栓的形成和使已形成的血栓溶解。故可以得出结论：补阳还五汤对中性粒细胞胞外诱补网形成的血栓溶解具有一定作用。而此结论可以对临床上血管栓塞类疾病的治疗具有积极的指导意义。