丝素蛋白在骨组织工程中的应用进展

李婧

中国人民解放军第89医院（山东潍坊 261021）

骨作为一种致密的结缔组织，在保护体内器官和提供机械支持、造血、矿物质储存方面发挥重要作用。尽管骨具有再生和自我修复能力，但是严重创伤、肿瘤切除或先天性疾病造成的大段骨缺损只能采用骨移植的方法修复。鉴于自体骨和异体骨移植的相对局限性，组织工程技术修复骨缺损一直是近年来的研究热点，其中作为天然组织和接种细胞之间桥梁的生物材料支架则是重要研究内容[1，2]。为了获得与天然骨相似的组成、结构和功能，生物材料应满足以下方面：1.具有良好的生物相容性和生物活性，可调节的生物降解性，且降解率应与新骨生长率匹配；2.具有模拟天然骨的结构特征，为不同细胞和组织的生长提供必需的空间和环境，有利于细胞外基质（extracellular matrix，ECM）形成、养料转运和神经血管长入；3.可塑性强，易于操作，能实现临床上不同病例所需的外部形态和内部结构的重塑，提供长期的稳定性；4.具有良好的成骨诱导性，能诱导接种细胞定向分化，促进骨组织形成，最终实现从人工到生物的转化[3]。

丝素蛋白（silk fibroin，SF）是一组具有广泛生物活性的天然蛋白，来自蚕丝和蛛丝等天然原料，容易获得且价格低廉。SF在生物技术、材料科学、医学和药物学以及光电子技术中都有广泛应用。SF具有良好的生物相容性、可控的生物降解性、良好的氧气和水蒸气渗透性、高拉伸强度和低免疫原性等特征，采用不同方法可以将SF加工成凝胶、薄膜、纳米纤维、纳米颗粒、支架和海绵样结构等多种形式，发挥支持、转运和诱导等作用，是理想的组织工程材料[4-6]。本文就近年来SF在骨组织工程中的应用进展进行综述。

1 SF的结构组成决定了其功能多样性

SF是蚕丝蛋白的核心成分，分子中含有一条重链和一条轻链，彼此通过二硫键连接形成复合物。重链中含有疏水性结构域（主要由酪氨酸和丝氨酸组成），能形成稳定的反向平行的β片层晶体；轻链中含有亲水性更强的氨基酸序列（主要由甘氨酸和丙氨酸组成）。因此，SF具有两性分子特征（amphiphilic feature）[7]。来自不同物种的SF氨基酸组成存在一定的差异，氨基酸的浓度和排列方式决定了SF的理化性质。例如，多聚丙氨酸序列含量高的SF在酸性溶剂中溶解度降低；而含有多聚甘氨酸-丙氨酸序列的SF则具有更多的β片层结构。β片层结构使得SF具有高度的机械强度。研究表明SF的强度要优于当前已知强度最好的合成材料，如Kevlar®[8]。通过调节SF结构中β片层结构含量，可以使SF的降解率在几小时到几年的范围内变化。一般来说，随着β片层浓度的增加，SF降解率降低[9]。据此可以制备不同生物稳定性的SF生物材料，满足临床的实际需要。SF表面存在多个修饰位点，可通过不同修饰途径，使抗体、染料、药物、荧光物质、生长因子、肽和纳米颗粒等被融入到SF材料中，形成具有不同表面形态或信号特征的衍生物，从而改进SF材料与各种细胞的相互作用。例如，SF氨基功能化可赋予其一定的物理性质（如电导性、光学性质和溶解性）以及生物学功能（如抗菌性、细胞应答和治疗作用）。基于酪氨酸的重氮偶联反应可以使富含酪氨酸的SF改变表面化学特征和亲水性，促进间充质干细胞的粘附、增殖和分化[4，7]。除了氨基功能化，SF还能发生加成、偶联、交联和共聚合等反应。例如，经共价修饰将整合素受体识别序列RGD（arginine-glycine-aspartic acid）与SF材料偶联，进一步提高细胞的亲和性和增殖活性[10，11]。此外，利用转基因技术对SF的氨基酸组成进行特定地遗传修饰，可以扩展其在生物医学中的应用范围[12]。可见，SF的结构特点为研究者提供了更广阔的操作空间，可以使SF材料在模拟不同硬度、不同降解率以及不同功能的组织中更具灵活性，有利于满足未来临床对生物材料功能多样性的需求。

2 SF在引导骨再生中的作用

引导骨再生（guided bone regeneration，GBR）技术已被广泛证明能增加缺损部位宿主骨数量和质量。其原理是用生物相容性材料在骨缺损部位制成屏障，阻挡快速生长的上皮细胞和成纤维细胞侵入骨缺损部位。同时，维持一个隔离的空间为成骨细胞增殖和新骨形成提供必要的时间[13]。理想的GBR膜应具备以下标准：良好的生物相容性、维持一定空间的机械强度、具备成骨作用、适当的降解率、临床可操作性及经济实用。根据降解性质，GBR膜可分为可吸收膜和不可吸收膜。不可吸收膜需要二次手术取出，会增加感染风险和经济负担。可吸收膜根据材料来源又可分为两类：合成聚合物，如聚乳酸（polylactic acid，PLA）和聚己酸内酯（polycaprolactone，PCL）；天然聚合物，如胶原蛋白和壳聚糖。可吸收膜在体内可完全降解，减少了患者再次经历手术过程的不适，但也存在一定的局限性。例如，合成聚合物在体内会引起广泛的宿主免疫反应以及术后肿胀现象，其降解产物通常呈酸性，可能溶解附近的骨组织。天然聚合物的机械强度较差，目前临床上广泛应用的胶原膜，主要来自牛胶原蛋白，存在感染海绵性脑病等传染性疾病的风险[14]。

性能优良的SF具备成为良好GBR膜的潜质，故研究者们不断探讨其作为GBR膜的可能性。SF能支持不同细胞生长，如内皮细胞、成骨细胞、神经胶质细胞等。Yoo等[15]实验证明了成骨样细胞MG63在SF膜上的粘附、增殖和存活。Kim等[16]比较研究了单纯SF膜与胶原膜Bio-Gide®在修复大鼠颅盖骨缺损模型中的作用。结果显示，尽管两种膜治疗组在术后第8周新骨形成的绝对体积无显著差异，且均大于无膜处理的对照组，但是在新骨生长速率方面存在一定差异。其中，无膜对照组在2～8周内总体较平稳，4周后维持相对低的骨再生速率；胶原膜治疗组在2～4周中呈现显著的骨再生，随后则增长较小；相反，SF膜治疗组在2～8周内均呈现显著的生长。Song等[17]为了改进壳聚糖膜的机械强度，通过引入SF制备出壳聚糖/SF-羟磷灰石复合膜，并比较了该复合膜与胶原膜Bio-Gide®在新骨形成和愈合效果方面的异同。结果表明该复合膜具有成为GBR膜的潜力。除了生物材料本身，制备技术也是影响膜性质和生物相容性的另一重要因素。Lu等[18]首先将蚕丝溶解在氯化钙甲酸溶液中，维持了蚕丝纳米纤维结构（直径在200～600 nm范围内），然后采用电喷技术制成SF纳米纤维膜。该膜具有多孔结构，孔径小于平均细胞大小，能阻止成纤维细胞的侵入，但允许营养物质和生长因子完成有效的交换；表面积与体积比例增加，可以模拟ECM样的空间结构，提供细胞生长所需的环境。在修复大鼠颅盖骨缺损的实验中，发现SF纳米纤维膜在机械拉伸强度方面优于作为对照的Bio-Gide®膜，且第4周时新骨体积和Ⅰ型胶原阳性率高于Bio-Gide®组。因GBR膜的机械稳定性是临床治疗成功的重要因素，且降解程度和速率能影响新骨形成，故该研究又比较了SF纳米纤维膜与胶原膜Bio-Gide®在体内降解的差异。结果显示，Bio-Gide®膜在移植后第4周开始出现吸收，到第12周后完全降解；相反，SF纳米纤维膜在第12周时仍保持着形态完整性，为骨再生提供了足够的空间和时间。

总之，SF能够作为制备GBR膜的重要生物材料来源，可以通过采用先进的制备技术对其性能进一步改良，更加满足理想GBR膜的特征，从而在骨缺损修复中发挥重要作用。

3 SF在复合材料中的作用

骨是由有机成分和无机成分共同组成的天然复合物，结构复杂。单纯依靠一种类型生物材料实现组织工程修复骨缺损，往往十分困难。故研究者在探索骨组织工程技术中，一般设计构建由两种及以上不同类型成分构成的复合材料，取长补短，改进支架的理化性质及功能特点，促进骨再生和骨缺损修复。SF广泛而优良的特性，使其成为制备复合材料的重要成分[19-21]。

骨质量的70%是由无机成分组成，其化学本质类似于羟磷灰石（hydroxyapatite，HA）。因此，HA在骨组织工程中应用广泛，常与胶原蛋白、壳聚糖、藻酸盐（al⁃ginate，AL）和SF等各种聚合物联合制备生物材料支架。Jo等[22]将适当质量比的SF、AL、和HA混合，经塑形、离子交换和干燥后制成复合颗粒，移植到大鼠颅盖骨缺损处，观察该复合颗粒的生物相容性和成骨作用。结果表明，相较于对照组，复合颗粒组在移植后第4周新骨形成明显增加；在移植后第8周，致炎性细胞因子肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）呈现较低的表达水平，而成骨标志物表达水平则显著升高；且在移植物周围组织中未发现炎性反应。推测SF的加入刺激了成骨细胞的增殖和成骨标志物的表达，从而有利于成骨分化和新骨再生，且SF在体内不会引发TNF-α分泌和诱导宿主免疫反应。

为了提高骨组织工程支架的力学性质和强度以及药物转运能力，Yao等[23]用SF和碳纳米管（carbon nano⁃tubes，CNTs）进一步修饰纳米羟磷灰石/聚酰胺66（na⁃no-hydroxyapatite/polyamide 66，nHA/PA66）支 架表面。支架的疏水性会影响其生物相容性。聚合物的吸水性与分子中化学键的极性有关。nHA/PA66支架中含有极性较强的PA66，其中的酰胺键极性非常强，很容易与水分子形成氢键，从而导致支架的高吸水性。吸水性强不利于接种细胞粘附、增殖和成骨作用形成，从而影响新骨组织的长入。而SF和CNTs则都具有疏水结构，故而SF和CNTs的表面修饰作用会改进nHA/PA66支架的吸水性。该研究结果显示SF/CNTs修饰后支架的吸水速率从62.51%减少到49.11%。此外，表面修饰后的nHA/PA66支架在孔隙度方面没有显著改变，抗压强度比修饰前提高了2%。支架的孔隙度和孔径对于细胞生长、养料运输和骨形成非常重要。高孔隙度和特定的表面积能增强接种细胞的粘附和生长、ECM沉积以及养料和氧气的转运。而对于骨组织工程支架要求更高，不仅要具备孔状结构和良好的生物相容性，而且必须具有足够的机械强度和骨传导性。要同时兼顾这两方面往往难度较大，因为孔隙度增加，机械强度势必降低。Park等[24]则用nHA修饰SF支架表面，希望nHA可以增加支架的硬度并加强SF支架的骨传导性和骨诱导性。实验结果证明了这一推断，并发现该复合支架在移植后第4周未被吸收，仍维持着缺损空间稳定性。由于SF吸收率可通过改变材料孔径、结晶度和质量分布等进行调节，因此可以根据缺损部位机械性能特点，决定是否选择SF材料及采用何种加工方法。例如，当缺损部位要发挥皮质桥连和长期支持作用时，可优先考虑选择SF支架用于这些负重较高区域的修复。

合成聚合物也是制备骨组织工程支架的重要来源，但其缺点是性质不活泼，表现疏水性，缺乏天然的细胞识别位点。由于SF具备固有的生物活性，能支持细胞粘附、促进成骨作用及ECM沉积，因此Wang等[25]将不同质量的SF加入到由PLA和PCL形成的共聚物PLCL[poly（lactide-co-ε-caprolactone）]中，并采用电喷技术制成纳米纤维结构，尝试改进合成聚合物PLCL支架的理化性质。结果发现，相对于单一的PLCL支架组，SF修饰后的PLCL支架组呈现更好的抗拉强度，表面粗糙度和亲水性更有利于细胞粘附和增殖，能够促进人间充质干细胞的成骨分化，增强了大鼠颅盖骨缺损的修复效果。

上述研究结果表明SF无论是作为支架的基本组分，还是作为表面修饰材料，均可以利用其独特优势改进骨组织工程支架的性能。当前，制备具有仿生结构和良好生物相容性、骨传导性和骨诱导性的复合材料是骨组织工程的研究重点。复合材料为实现骨组织工程技术更好的临床应用开辟了更广阔的新途径。

4 SF在骨组织工程血管化中的作用

骨是高度血管化组织。在生理状况下，血管生成先于成骨作用。血管形成是骨组织工程技术的关键和挑战[26]。有两种策略促进组织工程构建物的血管形成：一是基于生物材料本身的性质和结构，通过制成纳米纤维结构，模拟天然ECM形态结构，促进组织构建物的血管形成；二是基于细胞的策略。该策略可通过预制血管形成和导入血管生成因子两种途径得以实现。前者首先用内皮细胞接种组织构建物，然后植入一级宿主体内预制血管形成，最后再植入二级宿主体内。后者通过加入促血管生成生长因子或粘附蛋白等蛋白质，促进组织愈合和再生。

支架的几何学特征和力学性质与骨组织工程的血管形成存在一定关联[27]。Stoppato等[28]在具有三维多孔结构的多聚D，L乳酸（poly-D，L-lactic acid，PDLLA）海绵支架中，引入SF进行修饰，尝试构建能更好地支持内皮细胞定位、促进体内血管生成的支架材料。结果显示，与单一成分PDLLA支架相比，PDLLA/SF复合支架的硬度增加，其弹性模量是对照组的2倍，这可能归因于SF纤维的定向结构决定了支架的机械性质。体内灌注实验表明PDLLA/SF组能更早、更快地实现与宿主血管系统完全整合，这应归因于SF中的活性基团支持内皮细胞粘附和生长。Hofmann等[29]首次报道了整合素受体识别序列（RGD）修饰的不同孔径的SF支架的血管形成能力。研究者设计制备了小（106～212 μm）、中等（212～300 μm）和大（300～425 μm）三种孔径SF支架，分别接种间充质干细胞后体外分化成骨样组织，然后植入小鼠颅盖骨缺损处，观察血管形成情况及成骨作用。体外研究显示成骨作用取决于支架的孔径大小。其中大孔径支架组的骨体积和钙沉积均是最高的，可能归因于更加开放的结构有利于细胞穿过和养料供给，从而提高细胞分化活性。体内研究则显示无论起始孔径如何，所有的移植物均整合良好，血管形成加强，并开始了骨髓长入。这些体外构建的骨样组织在体内能够发生重塑，形成不同比例的编织骨/板层骨桥连缺损部位。尽管没有统计学意义，但研究者观察到中等和大孔径支架组相对于小孔径组有更好的血管形成倾向，推测可能小孔径移植物形成层状结构或是支架本身在一定程度上阻碍了血管长入。大孔径支架允许直接的血管形成和成骨作用，而更小孔径支架可能只是通过软骨内钙化形成骨样组织。该研究为体外设计构建不同几何结构的骨样组织提供了蓝本。实际上，采用合适的技术在体外构建小梁骨结构是可行的。此外，该研究也显示RGD序列修饰的SF支架在体内产生的炎性反应小，并且随着支架孔径的增加炎性细胞数量减少，可能由于更大的孔隙有利于血管生成，从而可以限制炎性反应的发生和强度。

最新研究表明干细胞在适当强度的材料上可以实现向内皮细胞的分化，而无需引入血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等稳定性较差的生长因子和多肽。这为通过调节支架强度设计制备具有血管生成能力的生物材料提供可能性。在制备不溶于水的SF支架过程中，往往伴随β片层含量增加，会增加支架的机械强度，但对血管生成不利。为了解决这个问题，Han等[30]通过控制蚕丝支架的纳米结构和二级构象以及调整蚕丝溶液的pH值，直接制备出具有晶体结构减少的不溶于水的蚕丝支架，软化了支架的强度。该支架的弹性模量为6 kPa。有研究揭示基质的弹性模量在1～7 kPa之间时有利于间充质干细胞分化成内皮细胞。因此该研究中制备的支架可以为血管形成提供物理信号和有利的微环境。为了排除纳米纤维结构对细胞分化的影响，Han等又用不同方法制备了具有类似纳米纤维结构但强度更高（12.5 kPa）的SF支架。干细胞在此高强度支架上不显示分化成内皮细胞的能力。因此证明了机械性能在诱导干细胞向内皮细胞分化中的重要作用。

移植后的快速血管化是研究制备组织工程构建物的一个难点。快速的血管形成能避免移植物中心部位的坏死，并有利于成骨细胞分化。除了应用促血管生成因子外，还可以选择本身具有促血管生成能力的生物材料（如SF），或者根据需要设计具有特定几何结构和机械强度的材料支架，来协同促进骨组织工程血管化。

综上所述，丝素蛋白是机械强度较高的天然聚合物材料，结构中富含易于修饰的活性基团，生物相容性好，生物降解性可调，机械性能佳，免疫原性低，具有促血管生成能力，是满足骨组织工程需要的重要生物材料来源。在不断改进的新型加工技术的辅助下会呈现出更广泛的用途，从多方位满足骨组织工程的需要，为骨组织工程研究提供更广阔的探索空间。